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凝血因子ⅫC46T基因多态性和冠心病关系的初步研究

吴康松  
【摘要】: 目的与背景 凝血功能紊乱与冠心病的发生发展密切相关,冠心病患者大多存在凝血功能增强及纤溶活力受抑;凝血因子及抗纤溶物质对粥样硬化斑块的形成和发展具有重要意义;粥样斑块的破裂和血栓形成是不稳定心绞痛和急性心肌梗死的主要病理生理变化。 凝血因子Ⅻ(Coagulation factorⅫ,FⅫ,Hageman factor)是由肝脏合成的80kDa的丝氨酸蛋白酶。在体外当其与带负电荷的表面接触后引起FⅫ分子蛋白水解并活化为FⅪa,后者活化FⅪ。FⅫ也参与纤溶途径,可能途径为间接活化尿激酶,或是直接转化纤溶酶原为纤溶酶。在体外,FⅫ在凝血和纤溶中发挥关键作用,但其生理功能尚未完全明确。FⅫ的缺乏很少引起出血,但Halbmayer等报道证明FⅫ水平低与血栓栓塞有关,即使轻度降低也会增加静脉和动脉血栓栓塞的危险。Miller,Kohler等多个研究发现,FⅫa水平提高,导致冠心病危险性增加。 近年,位于FⅫ基因的启动子第46位的核苷酸发生C→T突变被发现,并确定其与血浆FⅫ水平降低有关。国外,对FⅫC46T基因多态性与冠心病的关系已进行 吴康松2004年浙江大学硕士研究生学位论文 Wu Kangsong dissertation for M.M 了一些研究,但其与冠心病的关系仍在争论中。在亚洲人群中C46T突变发生率高, 因此猜测,其冠心病发病率低可能与此突变有关。我们利用MSPCR技术研究FXll C46T基因多态性在中国汉族人群中的发生率,探讨其与冠心病的关系。 材料与方法 一、研究对象 冠心病组150例(男118名,女32名),平均年龄63.9士9.4岁,来自本院 心内科病房,均符合1979年WHO关于缺血性心脏病的诊断标准,并全部经选择性冠 状动脉造影证实,以左前降支、左回旋支、右冠状动脉及主要分支中任何一支血 管狭窄程度)50%为阳性。同时分为ACS(aeute eoronary syndrome,急性冠脉综合征) 亚组和非ACS亚组,ACS亚组包括不稳定性心绞痛患者64例、急性心梗患者44例, 非ACS亚组包括稳定性心绞痛患者42例。 对照组招5例(男121名,女64名),平均年龄62.3士9.4岁,冠状动脉造 影示为阴性。 所有研究对象均来自浙江地区汉族人群,无血缘关系。 二、方法 !.一般临床资料的收集:所有受试者均详细询问有无高血压、糖尿病、高脂血症、 吸烟史,并测定身高、体重及部分生化指标。 2.DNA抽提外周血经离心去上清后,置于一70℃冷冻保存。采用盐析法抽提外周 血基因组DNA。TE溶解,一20℃保存。 3.PCR扩增应用MSPCR技术,扩增Fxll基因中含有C46T的位点。MS尸C尺是为检测 点突变而设计的pCR技术,它分别在一端设计两条引物,一条为野生型,另一条为 突变型引物,另一端设计一条共同引物,突变型引物的突变碱基设计在引物的3’ 端。两上游引物长度相差8一10个碱基。经PCR扩增后可产生两种长度不一的产物, 不需限制性内切酶技术,即可将两等位基因分离。PCR反应体系,总体积为25扒1, 包含约IOOngDNA模板,200 p mol/L dNTPS,1.5 mmol/L MgCI:,0.75U Taq聚合酶, 吴康松2004年浙江大学硕士研究生学位论文 Wu Kangsong dissertation for M.M. 2.5 p 1 IOxBuffer,上游引物序列:5’一GGC AGC TGG ACC AAC GGA CC(;AC一3’ 为4pmool,5’一TCC TGG ATA丛C AGC TGG ACC AAC(;GA CG八AT一3’,为6pmol; 下游引物序列为5’一GAA CAA TCC TGG GAC AAT CCT GGI’一3’,为spm〔)1(上海生工 生物工程有限公司)。在PCR热循环仪Gene AmP System 2400上扩增,95℃预变性5 min,然后95aC 305,52aC 605和72℃305,共35次循环后72aC延伸10 mi。。 4,Fxll基因多态性分析46C等位基因的PCR产物长度为122bp,46T等位基因的 pCR产物长度为1 3 1 bp。将它们置于 120/0聚丙烯酞氨凝胶中电泳,按顺序予1 50V 10min,100V 90min,16OV 10min。电泳结束予银染法染色,肉眼观察分析。 三、统计学分析 基因型和等位基因频率采用直接计数法统计。研究对象与Hardy一weinberg平 衡的符合程度、基因型和等位基因频率的组间比较采用四格表x,检验和RxC列 联表x“检验,对样本数小于40的计数资料用四格表确切概率法,一般临床资料 中计量资料均采用均数士标准差(x士S)表示,组间统计学差异用t检验。以尸0.05 为差异有显著性。用SPSSIO.O软件包进行统计。 结果 一、临床资料和冠心病危险因素在冠心病组和对照组间的比较: 冠心病组和对照组的临床特点两组间平均年龄、体重指数、总胆固醇水平、 吸烟者比例无显著性差异(尸0.05);冠心病组低密度脂蛋白水平及高血压、糖 尿病患者比例高于对照组,差异有显著性(P0.05)。 二、C46T基因多态性的电泳结果及基因型分析: 冠心病组和对照组均可观察到C、T两种等位基因和三种基因型。其中CC、TT 基因型仅有一条带,大小分别为122bp和131bP:CT基因型按预期结果应为两条带, 但因C和T基因型的产物发生了杂交,在预期产物的后方产生了一条较暗的条带, 因此表现为有三条带。PCR产物经测序证实上游引物3’端未发生错配。 三、C46T基因多态性与APTT的关系: 所有研究对象中,进行部分凝


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