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ω-芋螺毒素M ⅦA的表达与纯化

陈小颖  
【摘要】: [目的] 芋螺毒素(Conotoxin,CTX)是海洋软体动物芋螺分泌的一类具特异生物活性的小肽神经毒素。一般含10~30个氨基酸,大多富含二硫键,按作用靶位及药理学活性,可分为α,ω,μ等家族。ω-CTX M ⅦA是电压敏感性钙通道(Voltage sensitive calcium channel,VSCC)阻断剂,主要作用于神经组织的N型VSCC。它由25个氨基酸组成,含6个Cys残基,组成三对二硫键。非临床研究证明它具双重效应,一方面阻断痛觉传递而具镇痛效应,另一方面抑制刺激毒性(Excitotoxic)神经递质释放,阻止神经元细胞病理性钙内流而有神经保护作用。因其直接作用于钙通道,无需第二信使或G蛋白介导,故不成瘾,可用于治疗晚期肿瘤、AIDS病、难治性神经疾病等引起的慢性重症疼痛。国外公司开发的M ⅦA无瘾镇痛药,已进入Ⅲ期临床试验。 本研究旨在利用基因工程方法,构建ω-CTX M ⅦA基因原核表达质粒,诱导表达芋螺毒素(CTX)和硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)的融合蛋白,经纯化制备高纯度融合蛋白,为进一步获得目的小肽并研究其生物学活性打下基础。[方法] 根据ω-CTX M ⅦA氨基酸序列,按大肠杆菌偏爱密码子推断设计其DNA片段,5’端添加Kpn Ⅰ酶切位点和肠激酶识别序列,3’端添加TAA终止密码子及EcoR Ⅰ酶切位点,分四个片段分别人工合成。合成的基因片段经退火、连接成完 浙江大学硕七学位论文陈小颖 整片段,插入经相应内切酶酶切后的原核表达载体pET-32a(+)。连接产物转化 感受态大肠杆菌DHS。,挑取转化菌落,分别抽提质粒,经DNA酶切、转化大 肠杆菌BLZI(DE3)小量诱导表达、质粒测序三步鉴定重组质粒的DNA序列。 将鉴定正确的重组表达质粒pET32a(+)一cTx转化感受态大肠杆菌BLZI (DE3),经IPTG诱导表达Tr优Tx融合蛋白。超声破菌后取上清液及沉淀分别 经SDS一队GE电泳检查,表明融合蛋白几乎都是可溶性的,存在于上清中,故 取上清纯化。 利用融合蛋白中的6xHis一Tag,采用金属鳌合亲和层析方法(Cu一IDA树脂) 纯化融合蛋白,经凝胶过滤除盐,将各次处理的产物分别取样用SDS一PAGE验 证含量及纯度,最后合并纯度较高的样品用RP一HPLc(Reverse一phase high一performanee liquid ehromatography)鉴定。 由于融合蛋白中含多个Cys残基,而目的蛋白CTX的生物学活性决定于它 所含的三对二硫键的正确配对,故先在纯化产物中加入一定浓度的琉基乙醇(p 一mercaPtoethanol,已一ME),还原所有可能形成的二硫键,然后在一定的盐浓度下 透析去除蛋白液中的卜ME,缓慢空气氧化使之配对形成天然结构的二硫键。 经还原氧化处理后的融合蛋白,采用经典的小鼠热板镇痛实验鉴定其生物学 活性。 l结果l 目的基因与载体基因连接产物转化DH5a后,挑取菌落分别抽提质粒筛选鉴 定。DNA酶切重组质粒证实有小片段基因插入,转化BLZI(DE3)菌,经小 量诱导表达出符合预计分子量的融合蛋白,DNA测序证实。一CTX M VllA基因 序列按预计方案正确插入原核表达载体pE下犯a(+)。 经测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BLZI(DE3),IPTG诱导大量表达,1汾x /C TX融合蛋白,SDS一队GE可见其分子量(MW)约1 9.7 KD符合预计值,表 达量约占细菌总蛋白的25%。 超声破菌后取上清用 Cu一IDA亲和层析柱纯化,凝胶过滤除盐后将各次取样 SDS一PAGE,可见纯度不一的目标融合蛋白。合并纯度较高的样品经RP一HPLC 鉴定,Trx/CTX融合蛋白纯度可达95%以上。 浙江大学硕士学位论文陈小颖 Trx/C TX融合蛋白经p一ME还原,空气缓慢氧化后形成天然结构的二硫键, 小鼠热板镇痛实验证实其具镇痛活性。 !结论! 。一CTxM珊A是由25个氨基酸组成的小肤,含三对二硫键,人工合成成本 高、毒性大,本实验用基因工程方法将。一CTX M VllA基因与原核基因表达载体 PET-32a(+)重组构成新的表达质粒,在大肠杆菌BLZI(DE3)中表达出Trx/C TX 融合蛋白,创建了一个简单、经济、高产量获得CTX蛋白的途径,融合表达扩 大了目标蛋白的分子量,避免了小肤难于检测的弊端,同时还可延长生物体内作 用的半衰期。 外源蛋白与Trx硫氧还蛋白融合表达有利于提高表达产物的稳定性,融合 蛋白大部分为水溶性,不易形成包涵体,避免了包涵体裂解、蛋白复性的繁琐及 其对蛋白生物学活性的破坏。Trx是大肠杆菌自身蛋白,故可提高mRNA翻译 效率,并避免宿主菌蛋白酶的攻击。 融合蛋白中含6xHis一Tag,表达后经金属鳌合层析方法可方便地从细菌总蛋 白中一步分离纯化,该层析方法温和,有利于保持蛋白生物活性。金属离子的选 择必须根据不同的蛋白性质,本实验经反复尝试确定使用铜离子,纯化效果优于 普遍采用的镍离子。 蛋白中的二硫键经p一ME还原,空气缓慢氧化可形成天然状态的二硫键结 构,从而恢复蛋白生物活性。 本实验设计目的小肤N端插入到肠激酶切割位点处,该酶对底物具高度专 一性,酶切条件较宽,为进一步研究获得。一CTXM珊A奠定基础。


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