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水稻抗病性相关的蛋白激酶基因OsBIMK2和OsBISERK1的克隆鉴定与功能分析

宋东辉  
【摘要】: 植物在与病原物的协同进化过程中,逐渐形成了一系列复杂高效的保护机制来抵御病原物的侵染。植物中抗病基因所决定的抗病性是一种高水平的品种对病原菌小种的专化抗性。同时,植物还形成了一套适应性更广的可诱导的抗病机制。由于植物可诱导抗病性是一种非特异的广谱抗病性形式,因而倍受关注。在我们实验室的前期研究中,运用抑制性差减杂交法构建了水稻诱导抗病性相关差别表达cDNA文库,分离鉴定了200多个在诱导抗病性中差别表达的cDNA。其中的2个克隆分别含有可能编码水稻MAPK(mitogen-activated protein kinases)和SERK(somatic embryogenesis receptor kinase)蛋白激酶的基因片段。本文克隆和鉴定了水稻中与苯并噻二唑(benzothiadiazole,BTH)诱导抗病性相关的编码MAPK的OsBIMK2基因和编码SERK的OsBISERK1基因全长cDNA;研究了OsBIMK2基因和OsBISERK1基因在水稻—稻瘟病菌亲和与非亲和互作过程中的表达模式;原核表达了OsBIMK2基因,获得重组OsBIMK2蛋白,并研究了重组OsBIMK2蛋白的生化特性;克隆了OsBIMK2基因的启动子序列,并运用农杆菌介导的瞬间表达系统分析鉴定了启动子中参与基因表达调控的可能顺式元件:将水稻OsBIMK2基因导入烟草,获得过量表达OsBIMK2基因的转基因植株,这些转基因植株中防卫反应基因PR-1组成型表达,并提高了抗病性。 在运用抑制性差减杂交法分离克隆的与BTH诱发的水稻诱导抗病性相关的差别表达cDNA中,克隆BIHN-n1(BI118686)和BNHN-4w(BI118743)分别含有585 bp和343 bp插入片段,序列搜索表明这两个克隆中的插入片段与植物MAPK和SERK蛋白激酶基因有较高的同源性。运用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,以水稻cDNA文库噬菌体DNA为模板,分别扩增了BIHN-n1和BNHN-4w克隆的5’和3’端缺失序列,获得全长cDNA序列信息。根据上述2个克隆的全长cDNA序列,运用PCR扩增获得全长cDNA克隆,分别命名为OsBIMK2(Oryza sativa L.benzothiadiazole-induced MAP kinase 2) 浙江大学博_卜学位论文 和OsB儿涟RKI(Q矛)za夕riva L.互enzothiadiazole一induced业旦丝1)。 05刀了彻琢卫全长eDNA序列为2132 bp,含有一个1521 bp的oRF区域,5’ 和3’分别含有205 bp和407bP的非编码区。口,刀刀以兀2 oRF序列预测编码一个 506氨基酸组成的MAPK蛋白,含有MAPK蛋白激酶所特有的n个Se叮h;保守 结构域以及一个特殊的可磷酸化三肤模体结构TDY。同源性比对以及系统进化树 分析表明,osBIMKZ蛋白与己知的其他植物MAPK蛋白在氨基酸序列水平上 有40一71%的同源性,与水稻中己知MAPK蛋白激酶有41 .7%一78.9%的同源性, 说明OsBIMKZ可能是一个新MAPK。Southem分析表明,OsBll以KZ以单拷贝 形式存在于水稻基因组。原核表达获得重组OsBIMKZ蛋白,而且重组osBIMKZ 蛋白在体外具有自我磷酸化活性,表明OsB挤孙佗基因编码一个具有生化活性的 MAPK。 由己知序列拼接出的osBisERKI全长cDNA序列为2349bP,含有一个1875 bp的ORF区域,5’和3’分别含有104 bp和371 bp的非编码区。OsBISERKI的 ORF序列预测编码一个624氨基酸组成的SERK蛋白。预测的osB巧ERKI蛋白 与己知的其他植物SERK蛋白在氨基酸水平上有75一85%的同源性。Southern分 析表明,OsBISERKI以多拷贝形式存在于水稻基因组。 分析研究了OsB挤办佗基因和口‘刀左汪洁梦刀基因在水稻诱导抗病性以及在水 稻一稻瘟病菌(Magnoportho grisea)亲和与非亲和互作中的表达模式。BTH诱 发处理和稻瘟病菌侵染6h内均能快速激活水稻口‘刀了材xZ和osBISERKI基因的 表达并维持较高表达水平。BTH诱发处理的水稻在与稻瘟病菌非亲和互作的 6一12h阶段,就能激活口‘刀扒办口和石污刀左汪次人7基因的快速表达。这些结果表 明水稻OsBIMKZ和OsBISERKI基因均在水稻MAPK信号传递链参与的诱导抗 性以及抗病基因控制的抗病反应的早期起作用。 根据口扭扒仃口基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列,采用PCR方法 克隆了3384 bp的口,刀扒办佗的基因组序列和上游2332 bp的启动子序列。osBIj讨人2 基因组DNA序列由9个内含子和10个外显子组成,其内含子共有13对正向重复 序列和4对反向重复序列,内含子的剪切机制符合植物中最常见的GU一AG形式。 分析 OsB扒办佗基因启动子序列,发现起始密码子Al,G上游2.3kb的区域内存在 一些与基因表达调控有关的顺式作用元件,如Dof转录因子、ELRE结合序列一 浙江人学博卜学位论文 GT-1结合序列、WB一box元件和W一box元件等。将OsBIMKZ基因启动子全长区域 及其5’一部分缺火构件连接在gus(B一glucuronidase)报道基因编码卜,之前,通过烟 草叶片瞬间表达系统发现,克隆的启动子区域中一1071bP或更长的片段在sA诱发 处理叶片后都表现出基本的启动子活性。说明在启动子这些区域中存在着受SA诱 导的表达口扔了M人卫基因所需的顺式作用元件。 将水稻OsB挤办佗基因导入到烟草,获得过量表达乙七刀从办佗基因的转基因烟 草。选用外源花椰菜花叶病毒组成型强表达启动子caMv3,S与载体系统 pcAMBIA1381构


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