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农杆菌及基因枪介导的茶树外源基因导入体系优化研究

吴姗  
【摘要】: 茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)作为我国一种重要的经济作物,其优良品种的培育和推广,是科技在茶叶生产中发挥效益的重要体现。仅仅依靠传统的育种方法已不能满足现代社会需求的迅猛发展。因而必须吸收和借鉴现代科学技术成果,利用这些新的方法和手段,培育出更优秀的茶树品种。植物转基因技术作为植物基因工程的一个重要组成部分,不仅为基因表达调控和遗传研究提供了一个理想的实验体系,更为植物(尤其是农作物)的定向改良和分子育种提供了一个有效的途径和方法。 本研究在前人的基础上,优化了茶树的遗传转化系统。主要内容如下: 进一步调整了茶树常用的遗传转化体系—农杆菌体系。在用农杆菌浸染前,将茶树外植体预培养在含有PVP(16g/L)的预培养基上2-3d可提高转化频率。但在预培养基中添加CaCl_2反而使转化频率降低。 对基因枪介导的茶树转化体系的有关参数进行优化。比较了不同的预培养条件,结果表明:AgNO_3对转化频率影响不大;此外,茶树外植体若在含有AgNO_3的培养基上培养时间超过30d,会发生褐化。当AgNO_3和CaCl_2与PVP一起用于预培养时,得到的转化率最高。即使在没有AgNO_3和CaCl_2的条件下,在愈伤诱导培养基(1/2MS+2,4-D+KT)中添加PVP作为预培养培养基,也能得到较好的转化效果。渗透处理不仅不能提高GUS的表达率,反而使愈伤再生困难。优化后的基因枪转化制弹程序为:60mg/ml钨粉悬浮液10μl中加入1.6μl质粒DNA(1μg/μl),再分别加入0.1M的亚精胺4μl,2.5M的CaCl_2 15μl,最后定容至48μl;每次轰击上样量为8-10μl。在轰击压力7MPa,射程5cm,真空度-0.095MPa的条件下轰击一次,不论对GUS表达还是愈伤的再生都是较为适合的轰击条件。基因枪转化后抗性筛选2个月,抗性愈伤组织存活率为5.0%~12.1%。 比较了农杆菌法(AGR),基因枪法(BOM)及农杆菌与基因枪结合(BTA,BPA和BOA)等方法对茶树遗传转化效率的影响。瞬间表达的结果及抗性愈伤 筛选的结果都显示,农杆菌与基因枪结合使用比两种方法单独使用更有助于提高 茶树转化的效率。 本实验中三个茶树品种一乌牛早、劲峰和紫笋得到的转化频率相似。根据本 实验的结果,品种对转化的影响,不存在于品种间细胞感受能力的差异;然而, 可能不同品种间再生能力的强弱是实验成败的另一个关键。


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