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十字花科植物CYP86MF同源基因的结构、功能及进化关系的研究

王玲平  
【摘要】: 十字花科(Cruciferae)植物是中国蔬菜作物中栽培面积最大的一类,在我国农业生产和人民生活中占有非常重要的地位,对十字花科植物种质资源的充分利用一直是人们努力的方向。但长期以来,对于十字花科族、属和种的划分存在很多问题和争议。随着分子生物学和生物信息学的发展,从分子水平阐明十字花科植物系统演化关系成为可能。利用叶绿体基因组、核基因组中的一些编码和非编码基因,以及核基因组中的一些重复序列、基因间隔区和多基因家族等来进行物种演化分类的研究越来越多。细胞色素P450是一个古老的基因超家族,在植物次生物质的代谢合成中起着极为重要的作用。本论文以已知的细胞色素P450基因超家族成员CYP86MF基因的保守区设计引物对十字花科重要蔬菜作物的6个属13个物种进行了同源序列的分离克隆,通过核酸序列的差异比较分析,研究了该基因在不同物种中的进化关系;同时,通过保守引物的PCR扩增和RACE相结合的方法对十字花科植物不同物种的细胞色素P450基因家族成员基因全长进行了分离克隆、鉴定和原核表达的研究,获得如下研究结果: (1)通过PCR从十字花科植物不同物种中扩增到11个可以推导出完整氨基酸序列的同源片段。这些CYP86MF同源片段的核苷酸序列相似性均在80%以上,所推导的氨基酸序列相似性都在70%以上。 (2)以大白菜‘黄芽14’(Brassica campestris pekinensis.cv.Huangya 14)为材料分离克隆到一个细胞色素P450基因,命名为BCCYP86MF5,cDNA全长1854 bp,含1575 bp的完整开放阅读框,编码524个氨基酸,其编码蛋白质的分子量为61.2 kDa、等电点为8.96;碱性氨基酸、酸性氨基酸、疏水氨基酸和极性氨基酸分别占总氨基酸的13.74%、11.64%、36.45%和22.70%;二级结构预测包括N-糖基化位点、依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酪氨基酸激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点和细胞色素P450的典型区域,半胱氨酸亚铁血红素配体信号区等,α-螺旋和β-折叠分别占47.7%、45.0%;与BCCYP86MF1基因的氨基酸序列同源性达到95.2%,与拟南芥CYP86C4的达到85.9%。该基因DNA与cDNA的序列比较发现没有内含子存在,Northern杂交分析表明其在花蕾中特异表达。 (3)以萝卜‘圆白’(Raphanus sativus cv.Yuanbai)为材料分离克隆到一个细胞色素P450基因,命名为RSCYP86MF,cDNA全长1818 bp,含1581 bp的完整开放阅读框,编码526个氨基酸,推测的蛋白质分子量60.9 kDa、等电点8.686,碱性氨基酸、酸性氨基酸、疏水氨基酸和极性氨基酸分别占总氨基酸的13.12%、11.59%、36.69%和23.19%;推测的蛋白质含有细 摘要 胞色素P45O的典烈特征,包含一个细胞色素半肤氨酸亚铁血红素配体信号区(FNAGPRLcIG), 在其氨基酸的N端有一典型的疏水区:另外还含有与BCCYPS石人仔万基因所编蛋自质相同的结 构域,仅数目差别。蛋白二级结构中a一螺旋和p折叠分别.!l’45.2%、47.1%:与BcCYp86初下I、 Atlgl3150的氨基酸同源性分别为9。%、84%,与拟南芥CYP86家族的所有成员的同源性均人 T.38%。该基因无内含子存在,Northem杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。 (4)以诸葛菜(口尽动印内阳g优us vtolace。)为材料分离克隆到一个细胞色素P450基因, 命名为口vcyps“成尸,cDNA全长1 876bP,含有1 605bP的完整开放阅读框,编码534个氨 基酸,所编码的蛋白质分子量为61.4切a、等电点为6.90,其碱性氨基酸、酸性氨基酸、疏 水氨基酸和极性氨基酸分别占总氨基酸的12.35%、12.73%、37.08%和23.59%:与 BCCYP86人仔万和尺占CYPS石初下相比,所编码的蛋白质二级结构中无cAMP和cGMP的蛋白激 酶磷酸化位点,其它结构域的数目也不相同,a一螺旋和p折叠分别占44.9%,46.3%;与CYPS‘cJ、 CYPS石C4和BCCYP86材下I的核昔酸序列相似性分别为86%、84%和83%,而氨基酸相似性 依次为84%、79%和73%,与拟南芥CYP86家族成员氨基酸序列的相似性最低也达38%。 该基因无内含子存在,Northem杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。 (5)将BCCYP86材下I和天客CYPS石初下基因转化到大肠杆菌BLZI中诱导表达,发现T-28℃、 1 mmol·L’,的IPTG、诱导20h的条件下,PGEx一BCcyp86叼Fl、PGEX.尺刃了尸召‘初下两个重组 质粒均有约80 kDa的蛋白质特征条带出现。 (6)C钾86MF同源基因片段在13个物种中的序列分析表明:它们的核昔酸差异为1 .0% 一23.6%,序列差异较适中,适于系统发育分析的研究。除及少CYPS石初下外,属内核酸序列的 差异为1.0%一5.7%,氨基酸序列的为2.6%~7.3%,而属间两者的差异分别为5.6%一22,5% 和7.3%一31.2%,物种属间核酸和氨基酸序列的差异比属内要大的多.核营酸的替换土要以 转换为土,表现出高的转换偏倚。用NJ法和MP法构建的系统进化树具有完全相同的拓扑 结构,系统进化树可分为3个大的分支,诸葛菜和芥菜归为一个亚群后再与莽菜聚为一类,白举 置信水平值为BCL七引%;拟南芥和高掉菜聚为一个支系,BCL全88%;其余的物种归为一类。 演化


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