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家蚕核型多角体病毒几丁质基因的克隆表达及表达产物对Bt杀虫剂的增效作用

顾奇伟  
【摘要】: 杆状病毒是鳞翅目昆虫重要的病原微生物,在农业害虫防治中具有很大的应用前景。同时杆状病毒-昆虫(虫体)表达系统是最近发展起来的高效表达外源基因的真核表达系统。因此杆状病毒近年倍受重视,相关的分子生物学研究得到迅速发展。本论文应用现代分子生物学和基因工程技术对家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)几丁质酶基因进行表达和表达产物对Bt杀虫剂的增效作用的研究。 1、从基因组扩增了BmNPV几丁质酶全部编码区基因(chiA)和BmNPV缺失假定信号肽的几丁质酶的编码区基因(chis-)。将chi按其阅读框构建到pET28a原核表达载体T7强启动子下,得到pETchiA重组质粒。再将pETchiA转入大肠杆菌DE3中诱导进行融合表达,通过SDS-PAGE及Western印迹检测,确定表达出分子量为64kD左右的蛋白。薄层扫描显示,表达产物占细胞总蛋白的22%。 2、将PCR扩增出的BmNPV chis-基因构建到杆状病毒-昆虫(Bac-to-Bac)表达系统的供体质粒pFASTBACHTb中,目的基因构建在多角体蛋白基因强启动子控制下,并与6×His tag融合表达。通过转座作用将目的基因重组进穿梭载体Bacmid中,重组Bacmidchis- DNA在Lipofectin介导下共转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系(Tn-581-4)。连续传代感染四次后,经PCR检测鉴定转染成功的重组病毒含有目的基因。对感染细胞进行SDS-PAGE分析及Western印迹检测,表明有特异性表达条带,其分子量为63kD左右。薄层扫描显示,表达产物占细胞总蛋白的12%。 3、将以上BmNPV几丁质酶全部编码区基因(chiA)在大肠杆菌和BmNPV缺失假定信号肽的几丁质酶的编码区基因(chis-)在昆虫细胞中的两种表达产物分别加入Bt菌液中一起喂食2龄家蚕,观察并记录不同处理条件下家蚕的死亡时间及死亡时的体重,测算出其LT_(50)和LT_(90)值。实验结果表明,取食了添加BmNPV表达产物的家蚕较对照处理相比,LT_(50)死亡时间明显分别提前24.5 h和25.6 h,体重增量显著偏少。利用TDM模型综合分析,结果表明所得的两种表达产物对Bt杀虫活性具有增效作用。


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