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热凝胶多糖(Curdlan)生产工艺及其分子结构的研究

李卫旗  
【摘要】: 热凝胶多糖(Curdlan,又名可德兰)是由细菌发酵生产的胞外直链无分枝β-(1,3)-D-葡聚糖,因其特定的热凝胶性和独特的分子结构而在食品、轻工、医药、保健等领域有广泛的应用开发价值。本文从诱变筛选高性能生产菌株着手,研究了Curdlan的发酵特性,优化了发酵培养基的组成和发酵培养条件,分析了Curdlan间歇发酵过程中发酵液的流变学特性及气液传质状态,并提出了Curdlan的分批发酵动力学模型,探讨了Curdlan的提取、分离和纯化工艺,对Curdlan样品的分子结构及其改性进行了探索研究。主要的研究结果如下: 1.利用~(60)Co γ射线辐照对出发菌——粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)变种GM-24的菌体细胞和原生质体进行同步处理诱变处理。结果表明,适当剂量的~(60)Co γ辐射对产Curdlan菌株GM-24的菌体细胞和原生质体均有较好的正突变诱变作用,而对原生质体的诱变效果尤为明显,原生质体经~(60)Co γ辐射后,其正突变率、最优突变株的多糖产量提高幅度、突变株的遗传稳定性都高于菌体细胞,尚未发现国内外有相关的文献报导。 与出发菌株GM-24相比,最终选得的原生质体突变株A38的生产性能有了显著改善,其糖转化率从38.7%提高至58.2%,Curdlan产量从15.35 g.L~(-1)上升到22.3 g.L~(-1),提高了50.4%,发酵周期时间缩短了18%。A38的遗传性能稳定,连续翻接5代后发酵性能维持良好,。 2.对菌株A38的底物组分单因素实验表明,葡萄糖、蔗糖、糖蜜和可溶性淀粉作为发酵的碳源都可以生产Curdlan,但以葡萄糖为最佳碳源,酵母粉为最佳氮源,适量的碳酸钙不仅可以促进Curdlan的发酵生产,而且能够维持发酵液的pH的稳定。 正交实验表明氮源对Curdlan产物得率的影响最显著,碳源影响显著,MgSO_4.7H_2O有较显著影响,KH_2PO_4的影响较不显著。作为辅助因素,尿嘧啶对Curdlan发酵的影响比柠檬酸钾明显。 利用响应面分析法(RSM)获得的最优培养基组合为(g.L~(-1)):葡萄糖49.5,酵母粉7.64,尿嘧啶0.32,KH_2PO_40.22,MgSO_4.7H_2O0.31,CaCO_3 2.0,柠檬酸钾0.2。菌株A38在优化的培养基中发酵培养72h,所得Curdlan最高产量为26.32g.L~(-1),比培养基优化前提高了18%。 发酵结果表明菌株A38菌体生长与产Curdlan为部分偶联型,在菌体对数生长阶段没有Curdlan产出,Curdlan在氮源基本消耗完后菌体进入平衡期后开始生产。 3.发酵条件的单因素实验表明,发酵种子液的适宜种龄为10h接种量为10%(V/V),摇瓶装液量为500ml瓶装100~125ml,摇床转速200rpm,助溶氧 剂PPE和一!菜油有助于改善发酵液的溶氧水平,适宜的发酵温度为30一32℃, 培养基初始pH为7.0,产胶阶段pH为5.2一6。,发酵周期为72h左右。 应用响应面设计(RSM)优化的C盯dlan发酵的培养条件为:种龄9.9h, 接种量9.8%,摇床转速208rpm,发酵培养基初始pH7.0,产胶阶段pH为5.2, 发酵温度为30℃,发酵周期70.911,在优化的培养条件下生产Curdlan,得到 的发酵多糖产量为29.88g.L’‘,比培养条件优化之前提高了13.6%。 3.7L自动发酵罐实验表明以优化的培养基和培养条件进行分批发酵,考 察罐发酵过程中Curdlan浓度与发酵液粘度的变化趋势,首次得到用发酵液粘 度预测C盯dlan产量浓度的模型方程。 4.通过对C盯dlan发酵液在不同阶段流变特性的分析,发现C盯dlan发酵 液在平衡期阶段由牛顿型流体转为假塑性流体,流体流变特性趋于复杂,发 酵过程的溶氧传质机制好坏,主要取决于反应器搅拌转速的影响。具体反映 在: (1)搅拌转速在600r/min以内时,搅拌转速越高,菌体的生长速率越 快,最终细胞千重越大,细胞产率也较高,但发酵周期却基本相同。 (2)当转速从35Or/min提高到60Or/min时,多糖的终产量由13.459/L 上升到29.49/L。但继续提高转速达75Or/min后,多糖产量迅速下降,多糖 的得率系数变化也呈相同的变化趋势。 (3)Curdtan的最终分子量随着搅拌转速的提高不断下降,在35Or/min 时是63500 Da,到900r/min时则只有2650ODa。 (4)适当的高搅拌转速(6O0r/min)下,发酵体系处于良好的搅拌状态, 前期有效体积为100%,到产糖最高时(6Oh)也有86%。而低转速搅拌时, 有效体积随着发酵时间的推进不断下降,Curdlan合成的产量也明显降低。 Curdlan传氧系数kLa是生物反应系统中的一个限制性因素,搅拌转速和 kLa之间几乎成正比关系,C盯dlan浓度的增高也明显降低了气体在溶液中的 k,a值。 5.用Logistie方程和Luedeking一piret方程分别描述A3s菌体生长、产 物合成动力学规律,并据发酵过程中的底物消耗主要用于菌体生长与产物合 成及相关的代谢规律,首次对分批发酵动力学进行了初步探索,得到其发酵 动力学方程为: (1)菌体生长动力学方程 0 .2e0·155‘ 0 .9723+0.0277eol55‘ (2)月包外多糖生成动力学方程 S=50.04 0 .04e0155‘ 0 .9723+o.0277eo4155‘ +8 .O183ln(0.9723+O.O277e。”,‘) (3)底物消耗动力学方程 P=10.96161n(0.9723+0.0277eo·”,‘ 0 .52


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