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银杏再生体系建立和LEAFY基因表达、转化的研究

郭长禄  
【摘要】: 银杏(Ginkgo biloba)又名白果、公孙树,新生代第四纪冰川期的孑遗植物,为我国独存的珍稀名贵树种。我国是银杏的故乡,银杏与大熊猫一样,已被世界各国公认为中国代表。银杏被称为“活化石”,植物学家常把银杏与“恐龙”相提并论,在生物的起源、进化等研究方面提供了理想的试材和有力证据,具有重要的科学研究价值。银杏的经济价值很高,随着银杏产业的发展,银杏在食品、保健、医药、木材、绿化等领域得到广泛的开发利用,然而银杏童期长,实生苗20-30 a才能开花结果,常规育种周期较长,严重影响了银杏的品种改良。目前LEAFY基因被认为是诱导植物开花的枢纽基因,其过量表达可以促进植物提早开花。研究银杏LEAFY同源基因的时空表达模式有助于我们初步认识LEAFY同源基因的功能。通过组织培养、遗传转化等方法从分子水平对其进行改良,可以开辟银杏育种新途径。 我们通过实验获得了以下研究成果: 1.裸子植物银杏组织培养分化特别困难,分别以银杏胚乳、胚、胚轴、子叶以及不同采收期的未成熟胚为外植体,研究了在不同培养条件下愈伤组织和胚状体的发生条件,建立了MK新型培养基配方,结果显示,只有未成熟胚及其胚轴、子叶能够产生胚状体。大于3mm的未成熟胚,在MK+NAA 1 mg/L+BA 1 mg/L培养基上胚状体诱导率最高,达到53.6%,最多的一块愈伤组织形成多达38个胚状体;胚轴最佳诱导条件为:MK+NAA 1 mg/L+BA 1 mg/L,诱导率为45.3%;子叶最佳诱导条件为:MK+NAA 1.5 mg/L+BA 1 mg/L,诱导率为12.9%。暗培养不利于胚状体的发生。不同采收期的未成熟胚愈伤组织和胚状体的诱导率不同。 2.在国内外首次把胚状体培育成苗,建立了银杏组织培养再生体系。利用银杏未成熟胚诱导的胚状体在无菌的条件下,接种在添加不同浓度的活性炭、蔗糖、椰汁的MK培养基上,胚状体可以发育成苗。其中在MK培养基上添加3 g/L活性炭,有10%胚状体生长成苗。在MK培养基上添加40 g/L蔗糖,有19.2%胚 状体生长成苗。在MK培养基上添加10%椰汁对胚状体生长发育的促进效果最好, 有34.5%的胚状体生长成苗。 3.通过对传统CTAB提取RNA的方法进行适当改良,建立了银杏等木本裸子 植物RNA的提取方法。提高提取缓冲液中的p一琉基乙醇的含量,有效地去除了 多酚类物质对银杏RNA提取的影响;在研磨过程中,适当加入聚乙烯毗咯烷酮 (PVP),防止了酚类物质被氧化,从而获得了高质量的银杏RNA样品。经紫外分 光光度计、琼脂糖凝胶电泳分析,RNA完整性好、不降解、杂质少、纯度高,同 时也适用于反转录、、RT一PCR和Northern杂交等研究,为银杏的分子生物学研究 奠定了基础。 4.LEA那基因是调控植物开花的关键基因,裸子植物银杏童期长,也许是 由LEAFy同源基因所决定的,我们利用同位素标记,制备Gin妙和Gin从梅两个 特异探针,进行Northern分子杂交,对银杏还没有开花功能的幼树、已开过花的 银杏成年雄株和雌株的根、茎、叶以及幼果、不同时期的雌花芽、雄花芽进行了 LEA那同源基因的表达分析,发现银杏乙州Fy同源基因Gin势在各部位都有表达, 属组成型表达,而另一个同源基因GinNdlJ笋只在银杏雌花芽、雄花芽和叶片中表 达,属特异性表达。由此可知,银杏双拷贝乙别那同源基因中的GinN’lly基因与 银杏开花关系更为密切,同时也与叶片的发育有关,这也许是银杏长期进化的结 果。 5.进行了胚愈伤组织遗传转化的研究。通过卡那霉素筛选、PCR鉴定、 Southern杂交分析,证明乙EAFy基因己成功的整合到银杏胚愈伤组织基因组中, 进一步证明裸子植物银杏可以利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化。研究了影响 根癌农杆菌转化效率的因素。其中侵染的根癌农杆菌菌株、菌液浓度、共培养时 间、抽真空时间以及添加乙酞丁香酮等,对愈伤组织转化效率都有影响。根癌农 杆菌菌株EHA 1 05对愈伤组织的转化效率高于GV3lOI;根癌农杆菌菌株EHAIOS 培养到对数生长期后,稀释10倍使用,共培养3天,可以获得较好的转化效果, 转化率可达38%;加入300 p mol乙酞丁香酮,转化率可以升高到48%;而且浸 泡5 min后,抽真空10min,再浸泡5 min比单纯浸泡20 min的处理转化效率 局。


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