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两种微孢子虫的蛋白及对家蚕侵染性的比较研究

黄少康  
【摘要】:微孢子虫(Microsporidia)是专性细胞内寄生的原生动物,它的寄主几乎涵盖所有动物。既是昆虫、鱼、人等动物重要的病原微生物,同时又是很有前途的害虫生防制剂。微孢子虫的形态、侵染性变异,以及侵染机制等问题是防治动物微孢子虫病和微孢子虫生防应用中亟待解决的重要基础理论问题。微孢子虫以孢子发芽的方式侵染寄主,孢子发芽是侵染的先决条件,孢子表面蛋白又与发芽有关。因此,对微孢子虫蛋白质的研究,特别是对具有不同侵染性的微孢子虫孢子表面蛋白进行比较研究是寻找侵染性相关蛋白的一个有效的快捷途径。本研究选择三株两种的微孢子虫:家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,以下简称Nb)和经桑尺蠖(Hemerophila atrilineata [Phthonandria atrilineata])繁殖继代的Nb(简称Nbh),以及一种来源于家蚕的小型微孢子虫,对它们的形态、侵染性及孢子蛋白等方面进行了比较研究,发现了一些与形态、侵染变异有重要相关的候选蛋白,为解明微孢子虫的变异及侵染机制提供了重要依据。 1.建立了一种新的微孢子虫高速离心纯化方法。对高速离心和超速离心条件下的两种纯化方法进行比较,结果表明,以Percoll为介质的高速离心方法(4℃,46 000×g,90min)纯化所得的Nb孢子纯度和成熟度均近100%,完全可以替代Sato等(1980)的超速离心方法(4℃,73 000×g,30min)。对一内网虫属样(Endoreticulatus-like)的小型微孢子虫的纯化也证明此方法可行。我们认为,此高速离心法也适用于其他微孢子虫的分离纯化。对不同离心时间的试验结果表明,在4℃,离心力为46 000×g的条件下,30 min的离心未达到纯化要求,离心60min基本达到孢子的纯化要求,离心90min则可完全满足纯化要求。 2.家蚕微孢子虫的寄生导致家蚕肠道微生态变化,肠球菌(enterococci)数量增加,多样性明显下降。从健康家蚕(Bombyx mori)、家蚕微孢子病家蚕,及细菌性肠道病家蚕消化道分离了200株肠球菌,并进行了数值分类学鉴定。研究结果表明:与健康蚕相比,4龄或5龄起蚕添食家蚕微孢子虫孢子的微孢子病家蚕消化道内,肠球菌的数量分别增加5.5×10~5倍和0.74×10~2倍;菌种数从6个分别下降为3个和4个;生化表型数从27个分别下降为13个和14个;在菌种分布上,鸟肠球菌(Enterococcus avium)的分布频率从健康蚕的56%分别下降至20%和38%,而尿肠球菌(Ent.faecium)的分布频率从健康蚕的2%分别上升至40%和16%。分离菌株共有59个生化表型。 3.持续的转寄主寄生是引起微孢子虫形态、侵染性变异的重要原因。用家蚕微孢子虫(Nb)感染无微孢子虫感染的桑尺蠖(H.atrilineata),再从受感染的桑尺蠖中提取出Nb孢子(简称为1Nbh)再次感染无微孢子虫感染的桑尺蠖,如此繁殖继代24次,获得24 Nbh。对各继代孢子(Nbh)与Nb成熟孢子的形态比较表明,随着继代次数的增加,孢子逐渐变粗变短。与原代Nb相比,15Nbh 抱子显著变短(p0.05);24Nbh抱子长短径与Nb有极显著差异幼切.01)。当24Nbh回复感染家 蚕一次后,抱子形态迅速回复至10 Nbh的大小水平。对2龄起蚕的侵染性比较结果表明,24Nbh 的感染中浓度(Ies。)为1 .gsxzo4sporeszmL,而Nb为l.72xlo,sporeszmL,即24 Nbh对家蚕的侵 染性下降了11.5倍,表明Nb经桑尺镬传代24次后,对原寄主的侵染性显著下降。24Nbh回复感 染家蚕一次后的抱子对2龄起蚕的IC。。为Nb对照组的6.9倍,即对家蚕的侵染性又快速恢复。表 明,持续的转寄主寄生可引起微抱子虫形态、侵染性变异。 4.持续的转寄主寄生可引起微抱子虫表面蛋白的变异,Nb和24Nbh抱子表面蛋白中的特异差 异蛋白很可能是抱子发芽的关键蛋白。对Nb和24Nbh抱子表面蛋白进行了电泳比较。SDS一队GE 显示,两抱子表面蛋白的带型基本一致,均有4条主带(12 kD、17切、30 ko、33kD),但主要 蛋白在量上差异明显。ZD一队GE显示,当上样量为120林g时,两抱子表面蛋白都以中偏酸性蛋白 (P15一PI7)为主,但两种抱子表面蛋白在量和种类上均存在明显差异,发现5个可疑的特异(有 或无的)差异蛋白点,结合考查二者在侵染性的差异,推测这些特异的差异蛋白很可能是重要的侵 染性相关蛋白,与抱子发芽密切相关。 5.持续的转寄主寄生可引起微抱子虫总蛋白及抱内蛋白的变异。对Nb和24Nbh抱子总蛋白 进行了电泳比较表明,两抱子总蛋白SDs一以GE均显示至少25条带,带型基本一致,但18kD、 33kD一35 kD、45kD处的蛋白有明显量的差异。ZD一队GE显示,当上样量为220林g时,两图谱 显示的蛋白点丰富,均在300个以上。40多个差异蛋白点中,除发现4个特异的差异蛋白外,其 余均为量上有差异的蛋白。推测这些差异蛋白与形态、侵染性的变异有密切关系。 6.对分离自家蚕的一种小型微抱子虫(EsP)的形态、发芽性能、侵染性与家蚕微抱子虫进行 了比较研究。结果表明,Esp抱子大小为2.6妊0.27林m‘1.94士0.15林m(n=50);可形成多抱子抱囊, 囊内抱子多数,为8、16或35个以上,囊膜不明显:抱囊直径为5.0林m一11.3林m。极丝长45.1土 4.95林m(n=20)。在HZOZ及TEK(pHS.0)液中的发芽率比家蚕微抱子虫(Nb)明显低。对2龄起 蚕的xes。为1 .56X 106


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