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家蚕卵黄和胚胎蛋白质组及其催青期变动的研究

颜新培  
【摘要】:胚胎发育一直是生命科学研究的主题之一。家蚕是重要的模式实验昆虫,从一个受精卵发育成一个多细胞的个体,是许多基因在时间和空间上顺序表达的结果。家蚕在催青期按预定区域分化形成头、胸、腹及幼虫各种组织器官,但引起这些形态特征变化的基因功能并未解明。在后基因时代,功能基因组学成为研究的重点,蛋白质组是研究基因功能的重要方法,在目前家蚕胚胎发育机理尚未阐明的情况下,有必要开展家蚕催青期胚胎蛋白质组研究。 本研究采用固相化pH梯度(immobilized pH gradient IPG)双向电泳分离技术和生物质谱分析等鉴定技术,结合蛋白质数据库检索系统,进行家蚕催青期功能蛋白质组的研究。探索家蚕成熟卵中卵黄蛋白的组成和在催青期胚胎发育过程中的代谢变化;建立催青期各个发育阶段胚胎蛋白质双向电泳图谱,比较各个胚胎之间的特异蛋白斑点,并进一步阐明有关蛋白质的功能。 本研究首先从整体水平研究了家蚕成熟卵中卵黄蛋白的构成,从分子水平揭示家蚕卵黄蛋白在催青期胚胎发育中的变化。 通过对家蚕成熟卵中卵黄蛋白双向电泳图谱的比较分析,发现家蚕卵黄蛋白凝胶图像中能检测到200个左右蛋白斑点(前人研究报道有三类卵黄蛋白)。在本研究中卵黄磷蛋白(vitellin,Vn)、30kD蛋白和卵特异蛋白(Egg specific protein,ESP)三类高丰度蛋白占卵黄蛋白总量的65.5%,并且在分子质量标记为30kD区域有许多蛋白斑点,可能30kD存在着极为相似的多基因家族。对应于卵黄磷蛋白的42kD亚基的区域有10个高含量蛋白连在一起,这种现象的产生可能是蛋白质后加工的不同或试样调制时的影响,也可能是家蚕体内本身存在着极为相似的多基因家族。对多化性品种P50和二化性品种丰1处女蛾卵的卵黄蛋白进行了品种间比较。P50和丰1处女蛾卵的卵黄蛋白经双向电泳分离和银染后,能够检测得到的蛋白斑点数分别为203个和185个,蛋白斑点匹配率为77.84%。卵黄磷蛋白、30kD蛋白和卵特异蛋白三类高丰度蛋白含量也不相同。说明不同品种之间卵黄蛋白质存在着差异,暗示家蚕卵黄蛋白含量和种类与品种的化性、眠性、地理系统等因素有关。 进一步探讨了同一品种在不同发育时期卵黄蛋白的变化。P50品种己_2胚胎卵黄蛋白经双向电泳和银染色,能够检测到的蛋白斑点数约为197个,通过对P50处女蛾卵和发育到己_2胚胎的卵黄蛋白双向电泳图谱的匹配分析,两张图谱匹配率达93%,说明同一品种在胚胎发育过程中卵黄蛋白的种类基本相同。卵黄磷蛋白、30kD蛋白和卵特异蛋白这三类高丰度 家蚕卵黄和胚胎蛋白质组及其催青期变动的研究 蛋白含量也基本一致,并且其他相匹配的蛋白斑点含量大部分非常接近。这一结果暗示:就 恒定量卵黄蛋白进行分析,胚胎发育各个时期的卵黄蛋白的种类和含量是基本稳定的,即在 胚胎发育过程中,胚胎不是选择性地吸收卵黄蛋白中的某种或某些蛋白质,而是以卵黄颗粒 为单位,一个个地消耗吸收免疫性相同的蛋白胜卵黄颗粒来利用卵黄蛋白。 为了获得较满意的家蚕催青期胚胎蛋白质表达图谱,在充分比较了其它生物蛋白质提取 方法的基础上,通过多次重复实验,确立了适合于家蚕催青期胚胎蛋白质样品制备的顺序抽 提方法,即先用磷酸缓冲液提取胚胎易溶性蛋白,再用裂解缓冲液从其沉淀中提取胚胎难溶 性蛋白质,经电泳分离后,能够较完整地得到家蚕胚胎蛋白质组分。然后用连续发育的家蚕 催青期胚胎为材料,对催青期各个时期的胚胎蛋自质进行了分离。通过对家蚕催青期各胚胎 蛋白质表达谱的分析,在丙2胚胎检测到的467个蛋白斑点中,等电点在3一5之间的酸性蛋 白质大约占总蛋白斑点的巧.2既(71/467),等电点5一8之间的中性蛋白质大约占总蛋白斑 点的79.66%(372厂467),等电点8一10之间的碱性蛋白质大约占总蛋白斑点的5.14%(24/467): 在ZOkD以下的蛋白质大约占总蛋白斑点的8.99%(犯厂467):在ZOkD~7OkD之间的蛋白质大 约占总蛋白斑点的80.94%(378//467);在70kD以上的蛋白质大约占总蛋白斑点的 10.06%( 47/467)。研究发现在丙:胚胎检测到的467个蛋白斑点中,共有193个蛋白在以后 的胚胎发育过程中消失,其特征是在己,胚胎以前的发育过程中消失的个数较少,在己;、 己:胚胎期消失的个数较多。这说明在催青前期,胚胎蛋白质的变化较小,在催青后期,胚 胎蛋白质的变化较大。存在于丙:胚胎中蛋白斑点的变化,说明在催青期胚胎中,己。、己。 胚胎期的生理代谢活动可能与其他胚胎期开差较大,暗示了维持胚胎生命活动的基因与维持 蚕体生命活动的基因可能有较大的不同。另外,从丙:胚胎到己s胚胎一直存在的274个蛋 白斑点,可能是整个胚胎发育时期都必需的蛋白质,大多数可能是结构蛋白。以丙:胚子为 基础,按照胚子发育的顺序每个胚子蛋白质凝胶电泳图像与前一胚子蛋白质凝胶电泳图像相 比较,寻找各个胚胎时期的特异蛋白质斑点。其中,丁,胚胎、丁:胚胎、戊,胚胎、戊:胚 胎、戊3胚胎、己,胚胎、己2胚胎、己3胚胎、己;胚胎、己5胚胎分别出现29个、8个、 11个、52个、11个、11个、11个、55个、77个、22个共287个特异蛋白斑点.进一步对 催青期各个时期出现的特异蛋白斑点的变化


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