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鸡E.tenella 5401基因的克隆及免疫原性的研究

王素华  
【摘要】:鸡球虫病是危害养鸡业的最重要寄生虫病之一,引起很高的发病率和死亡率,给养鸡业造成很大的经济损失。目前,药物防治是控制球虫病的主要手段,但随着抗球虫株的普遍产生及绿色食品概念的形成,人们期望用更好的手段取代之。从60年代起人们就开始研究抗球虫疫苗,目前已有4种活疫苗被养鸡业采用,但主要用于种鸡,且存在一定的缺陷。80年代末,人们开始研究基因工程亚单位疫苗,并已获得了部分保护效果。本课题对E. tenella 5401基因进行了探索性研究,为进一步研究基因疫苗奠定基础。 用纯种E. tenella ZJ株孢子化卵囊5×10~4个/只接种15日龄无球虫雏鸡。接种后7天剖杀鸡只,取其盲肠,组织捣碎机打碎,用2mg/ml胃蛋白酶40℃下消化2小时,经蔗糖梯度离心,次氯酸处理,收集大量纯化卵囊,2.5%重铬酸钾中培养48小时,使卵囊孢子化。 以E. tenella ZJ株孢子化卵囊总RNA为模板进行RT-PCR。按照Danforth(1989)发表的基因序列合成引物,引物上下游各加上EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点,以便于插入载体中。PCR扩增产物与PGEM-T载体连接后,转化DH-5α感受态细胞,将酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序。结果表明,扩增得到的产物大小为881bp,ORF大小为864bp,与Danforth等(1989)报道的基因序列的同源性为99.8%,有两个部位的碱基发生了有义突变。与Danforth等报道的氨基酸序列同源性为99.3%。 用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切5401基因与克隆载体组成的重组质粒pGEM-T-5401,回收小片段;同时用相同的酶双酶切pET-30a质粒载体,二者连接后,转化E. coliBL21(DE3),碱裂解法抽提质粒,Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定为阳性重组质粒,构建成表达载体pET-30a-5401。 球虫子孢子表面抗原5401(31kDa)在实验中以蛋白二聚体的形式进行表达。以pET-30a为原核表达载体,用IPTG可诱导5401基因在E. coli BL21(DE3)中的表达。SDS-PAGE表明,融合蛋白大小约为66.2kDa,而非推测的38.5 kDa,诱导6h的蛋白表达量即可达到较高水平,表达量约26.3%。采用鼠抗His一抗和鸡抗鼠二抗进行Western-blot,成功检测到了特异性蛋白条带。 将pET-30a-5401融合蛋白、融合蛋白+弗氏佐剂、融合蛋白+0.25mg/ml人参皂甙、融合蛋白+0.5mg/ml人参皂甙、融合蛋白+1.0mg/ml人参皂甙及正常对照组,按照每只鸡100μg融合蛋白的剂量进行首免,两周后加强免疫一次,免疫前及一免后每周心脏采血,检测细胞免疫和体液免疫水平,持续6周。结果表明:融合蛋白+0.5mg/ml人参皂甙、融合蛋白+弗氏佐剂免疫组具有良好的免疫原性。各免疫组于一免后第二周开始出现特异性抗体,随后开始上升,一免后第五周达到较高水平;淋巴细胞转化水平同样于一免后第五周达到最高值。试验结果表明,中、高剂量人参皂甙具有较好的免疫增强作用。 设立上述相同的组别及攻虫不免疫对照组、药物对照组、活卵囊免疫组,并用相同的方法和剂量进行免疫。加强免疫后一周每只鸡按6×10~4个卵囊的剂量口服攻虫, 浙江大学硕士学位论文 观察其免疫保护效果。结果表明:5401融合蛋白+弗氏佐剂免疫组鸡只的增重率、相对 增重率、卵囊产量下降、病变积分下降、综合保护效果(ACI)数值最高、免疫保护性 最好;其次是5401融合蛋白+l .Omg/耐GS免疫组。说明免疫佐剂可以协助融合蛋白提 高免疫保护效果。 本研究以柔嫩艾美耳球虫ZJ株5401基因为外源目的基因,构建原核表达质粒 pET一30a--5401,并转化£coll BL21(DE3),在点cO了了中得到高效表达,分离纯化表达 的5401融合蛋白,进行免疫试验,并以弗氏佐剂和人参皂贰作为免疫增强剂,探讨其 免疫应答规律和免疫保护效果。此类研究在国内未见报道,研究结果对于进一步开发 基因工程苗以预防鸡球虫病具有重要意义。


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