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AtCBF1基因转化水稻和拟南芥的比较研究

金建凤  
【摘要】:低温是影响植物生长的重要环境限制因素。植物在低温处理后,一方面,传递低温信号和调控基因表达的调节性蛋白被诱导,另一方面,直接保护细胞的功能性蛋白也被诱导。拟南芥CBF1基因,是一个响应低温的转录激活因子,能开启一系列抗冷相关基因的表达。本实验以CBF1基因为主要研究对象,利用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织和拟南芥植株,并对转基因后代开展了抗冻性、形态变异观察、T-DNA插入位点分析以及遗传稳定性分析。同时还制作了一系列供深入研究CBF1功能的拟南芥遗传材料。取得以下主要结果: 1 将CBF1基因与CaMV-35S启动子融合构建植株表达载体pCAMBIA1301-CBF1,以农杆菌介导法转化水稻成熟胚愈伤组织和拟南芥植株,获得转化植株。经CBF1基因的PCR鉴定和转基因后代(水稻T1和拟南芥T1、T2和T3代)的潮霉素抗性分析和GUS报告基因分析,获得单位点插入的转基因水稻株系2个,拟南芥单位点插入的转基因纯系1个。 2 水稻植株和悬浮细胞的脯氨酸含量测定及小苗冻害观测结果表明,CBF1基因的表达有利于提高转基因植株的脯氨酸含量,进而提高植株的抗冻能力。 3 转基因水稻植株不产生矮化等表型变异;转基因拟南芥表型变异明显,3号株系出现白化叶等表型变异,但这些表型变异可能是由T-DNA插入突变引起。 4 利用Tail-PCR法进行T-DNA插入位点分析。在水稻基因组中检测到T-DNA的存在,但具体位置不能确定。拟南芥转基因植株中,确定了2个株系的插入位点。1号株系,插入在1号染色体上的一个At1g11670(功能未知)基因的第二个外显子内;3号株系,插入于3号染色体上的一个At3g49880基因(糖基水解酶)内部。故推测3号株系出现的白化叶等表型变异可能和T-DNA插入失活糖基水解酶有关。 5 利用杂交制作一系列带有CBF1基因的突变体植株,得到Abi4-1-CBF1、Abi3-CBF1及esk1-CBF1的纯系;同时利用转基因方法得到拟南芥转AEQ植株纯系(AEQ是从水母中分离,是胞内高度灵敏的生物发光Ca~(2+)指示剂)。


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