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根虫瘟霉基质特异性胞外蛋白酶的诱导表达及与毒力的相关性分析

盛亮  
【摘要】:胞外蛋白酶是昆虫病原真菌入侵寄主过程中的一个重要毒力因子,在降解表皮结构蛋白、激活酚氧化酶系等方面发挥着关键的作用。而不同种类的胞外蛋白酶具有不同的基质特异性,对不同的寄主也表现为不同的毒力。本研究通过转寄主各世代根虫瘟霉(Zoophthora radicans)菌株对小菜蛾(Plutella xylostella)的毒力测定、各世代菌株在不同培养液中蛋白酶种类和活力的检测及其与毒力的关联分析,发现了寄主基质对菌株毒力相关胞外蛋白酶的诱导作用,初步探明了菌株在适应新寄主过程中毒力变化的部分机制,明确了基质特异性胞外蛋白酶在提高菌株毒力方面的重要地位。 菌株的转寄主传代及毒力变化 经F99101和ARSEF1342两菌株分别以各自的最适剂量接种后,小菜蛾的死亡率均大幅上升。F99101致死的虫尸很少弹射分生孢子,未能成功传代;在少数虫尸体内发现有大量休眠孢子,证明小菜蛾体内的基质不适合菌株F99101的发育与繁殖;ARSEF1342的原始菌株R_0致死的部分虫尸体表密布分生孢子梗,并向周围弹射大量分生孢子,以此可逐代分离出菌株R_1~R_4,且随着传代的进行,菌株对小菜蛾的毒力呈现明显的上升趋势。经过四代次的适应,在250个分生孢子/mm~2的接种剂量下,菌株接种小菜蛾后8d内的累计死亡率由原来的14.9%升至27.3%;小菜蛾死亡高峰出现的时间也由原先的第5d提前至第2d,说明菌株对新寄主的入侵有所上升。 胞外蛋白酶系的诱导表达及与毒力的关联 不同寄主来源菌株在萨氏培养液中产生的胞外蛋白酶各不相同。ARSEF1100、ARSEF1136和ARSEF2699均有分子量为162kD的保守条带,ARSEF1100另外还有153kD和较微弱的148kD两条基质特异性蛋白酶,而ARSEF1136和ARSEF2699仅分别有153kD和148kD一条带;而F99101则产生218kD和207kD的两种蛋白酶。菌株的总酶活与对小菜蛾的毒力之间存在一定的关联,如产酶水平最低的ARSEF1342对小菜蛾的毒力显著低于其它菌株,产酶高峰与寄主死亡高峰间也存在对应关系,但两者的相关性未达显著水平(r=0.76)。在萨氏培养液中,ARSEF1342原始菌株(R_0)经转寄主传代培养后,丢失了原有的148kD条带,只产生162kD和153kD两条蛋白酶条带,其中153kD条带随着转寄主传代数增加逐步趋于明显。以小菜蛾虫尸粉培养液诱导菌株产酶,也产生相同的效果。而在菜粉蝶虫尸粉培养液的诱导 下,148kD重新产生并大量表达。该现象说明菌株在不同寄主基质的特异性诱导 下,能根据需要对蛋白酶系采取选择性表达。不同的蛋白酶系与菌株对寄主的毒 力间的相关性大相径庭。在萨氏培养液中,两者相关系数为0.784;在小菜蛾虫 尸粉培养液中,两者极显著正相关(r一0.9763,F=61 .1 786,p0.01)。而在菜粉 蝶虫尸粉培养液中,两者相关性较差(r=0.3675,F=O.4684,尸=0.5429)。这证明 了各种蛋白酶在面临不同寄主时的作用和地位会有变化,只有基质特异性蛋白酶 对毒力发挥着至关重要的作用,而菌株能在转寄主过程中逐渐增加针对新寄主的 基质特异性蛋白酶的表达,从而更适应对新寄主的入侵及致病。


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