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脑缺血损伤动态过程的研究及其应用

徐晓虹  
【摘要】:脑血管疾病是目前人类死亡和残疾的主要原因之一,该疾病的发生主要与脑血流减少和缺血性脑损伤有关。许多继发性因素,如缺血后神经胶质细胞功能的重新安排,离子平衡紊乱,自由基引起的脂质过氧化损伤,以及神经递质的改变等可诱导神经细胞死亡,继而导致脑损伤,但有关缺血性细胞死亡机制目前还无定论。 本研究通过建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的局部脑缺血/再灌注模型和海马神经细胞离体缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型,综合应用脑微透析—高效液相色谱技术、激光共聚焦显微技术结合特异性细胞内荧光标记、流式细胞技术、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)RNA扩增等技术,从整体、细胞、和分子水平研究了缺血性脑损伤的动态变化及其机制,并应用于中药葛根素抗脑缺血作用机制的研究。 首先应用大鼠局部脑缺血/再灌注模型观察了不同脑区脑损伤的发展过程,发现50min MCAO的局部脑缺血/再灌注诱导脑梗死是一个进行性发展成熟过程。急性缺血期间缺血区并不出现明显的脑梗死,直到再灌注4hr可见梗死灶出现。纹状体梗死灶发展快速,在缺血后24hr即接近成熟;而皮层梗死发展缓慢,可延续到3d后发展成熟。 为了探讨脑缺血的神经生化机制,本研究应用脑微透析—高效液相色谱技术分析了缺血区纹状体细胞外液氨基酸水平的动态过程。结果发现在急性脑缺血期间缺血区氨基酸释放大量增加,再灌注时氨基酸水平开始回落,再灌注2 hr趋向正常,24 hr已恢复正常水平,在以后观察的7d内脑内氨基酸维持正常水平。缺血诱导兴奋性氨基酸释放尤其显著,使Glu/GABA比值显著升高,再灌注后该比值下降,再灌注24hr趋向正常。 应用激光共聚焦显微技术结合Ca~(2+)荧光探针Fluo-3、NO荧光探针DAF-2 DA特异性细胞内标记技术,进一步检测了缺氧缺糖(OGD)状态下,体外培养海马神经细胞内Ca~(2+)水平和NO生成的动态变化。结果表明OGD诱导海马神经细胞内Ca~(2+)水平快速升高和NO大量合成,OGD10~15 min 浙江大学博士学位论文 时caZ十内流和No合成的增加趋于平缓,在以后15 min的OGD时间内一 直处于一个较高水平。并且发现oGD诱导的细胞内caZ十超载主要与细胞膜 NMDA受体激活相关,导致胞外C扩+大量内流。 以上结果表明,缺血缺氧可快速激活谷氨酸释放/C扩+内流/N0合成通 路,因此导致脑损伤。为了探讨脑损伤的细胞死亡机制,我们应用流式细 胞术结合特异性细胞荧光标记检测了缺血再灌注过程缺血中心区和周边区 细胞凋亡和坏死率的变化,发现局部脑缺血/再灌注的急性缺血期间并不发 生细胞死亡,细胞死亡在再灌注后逐渐发生,且细胞坏死要早于凋亡的发 生。另外,缺血中心和外周区均出现细胞凋亡和坏死,但缺血中心区主要 发生快速的坏死性细胞死亡,缺血再灌注shr其细胞坏死率即达最大值, 比正常大鼠高10倍多;而周边区主要发生延缓性细胞凋亡,缺血后24hr 细胞凋亡率才快速升高,并在3d达到高峰,比正常大鼠增加3倍多。提示 缺血中心区和周边区细胞死亡机制不同,缺血周边区的延缓性脑梗死灶成 熟与其迟发性细胞凋亡相关。 进一步用RT-PCR技术分析缺血再灌注过程中凋亡蛋白抑制剂XIAP (x一ehromosome一11吐eai曲ibitor of即optosis protein)mRNA在不同脑区表 达的时间变化过程,发现XIAP mRNA表达呈现时间和脑区依赖性的双相 变化。在缺血早期XIAP表达出现短暂性增强,其增强幅度和时间与缺血程 度呈负相关,之后X认P开始下调,下调幅度和持续时间与缺血程度正相关。 而且,各脑区的细胞凋亡率与XIAP表达水平呈负相关变化。提示缺血再灌 注后XIAP较长时间的表达上调和随后的下调可能是触发缺血外周区域延 缓性细胞凋亡,最终导致迟发性脑梗塞发展的原因之一。 本实验还应用海马神经细胞离体缺氧缺糖(O GD)模型,进一步观察了缺 氧程度与神经细胞损伤程度的相关性,发现细胞死亡率、XIAP表达与OGD 时间密切相关。短时间(lhr)OGD并不引起神经细胞死亡,此时细胞XIAP 表达上调;较长时间OGD(Zhr)诱导神经细胞XIAP mRNA表达下调,且与 时间相关。与此相对应,细胞死亡率也随OGD时间延长而增加。 本研究应用离体培养的海马神经细胞进一步观察了在缺血性脑损伤中 起重要作用的谷氨酸、caZ+、NO对神经细胞凋亡的直接影响,发现谷氨酸 浙江大学博士学位论文 可改变神经细胞XIAP mRNA表达,微弱的刺激使XIAP表达上调,此时神 经细胞不出现明显的凋亡;而大剂量(0.smM以上)谷氨酸刺激使XIAP 表达下调,细胞凋亡率增加。此外,抑制NMDA受体活性、阻断c扩十通道 以及抑制NOS活性均可抑制OGD引起的XIAP mRNA下调,并减少细胞 凋亡。这些结果提示,脑缺血或缺氧缺糖引起的谷氨酸释放、细胞内c扩+ 超载以及NO大量合成,可刺激神经细胞XIAP mRNA表达下调,最终导 致神经细胞凋亡。 综上所述,脑缺血损伤是一个进行性发展过程。局部脑缺血伤过程中, 脑梗死在缺血中心区发生较早,成熟较快,这与该区域缺血后神经细胞主 要发生快速坏死有关;缺血周边区发生迟缓性脑梗死,这与缺血引起的迟 发性细胞死亡有关,凋亡蛋白抑制剂XI


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