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壳聚糖酶的分离纯化和性能研究

隋斯光  
【摘要】:本文重点讨论了从壳聚糖粗酶液中分离提纯得到壳聚糖酶的整个过程,研究 了纯化的壳聚糖酶的酶学性质,并探索了混合酶法和内切酶法制备相对分子质量 50 kDa的壳低聚糖的过程。 首先探索了从Penicillium sp.ZD-Z1菌体发酵液中分离提纯壳聚糖酶的过 程。采用超滤法,以截留分子量2 kDa的超滤膜对发酵得到的粗酶液进行浓缩。 采用冰乙醇沉淀的方法从浓缩粗酶液中分离得到壳聚糖酶沉淀。比较了使用阴、 阳两种强离子交换剂下得到的壳聚糖酶分离效果,分离得到两种壳聚糖酶ChA 和ChB。使用Sephadex G-50对ChA进行进一步纯化,最终得到ChA的收率 为10. 5%,纯化倍数20. 8,50℃条件下比活475. 5 U/mg;ChB的收率为9. 4%, 纯化倍数2. 9,50℃条件下比活67. 5 U/mg。 然后对两种壳聚糖酶的酶学性质进行测试。采用等电聚焦的方法测定得ChA 和ChB的等电点分别为5. 21和5. 92。使用凝胶过滤法测得ChA和ChB的相对 分子质量分别为64 kDa和74 kDa;采用SDS-PAGE法测得ChA和ChB的相 对分子质量分别为43 kDa和115 kDa。在30 min内,以1%壳聚糖溶液作为底 物,ChA的最适反应pH为5. 0,最适反应温度为65℃;ChB的最适反应pH 为5. 5,最适反应温度为60℃。在50℃以下,ChA的热稳定性较强,2 h以 后仍能够保持75%以上的活性;ChB在55℃以下保温2 h仍能够保持90%以 上的活性。8种金属离子在1 mM和0. 1 mM下,对ChA的酶解均有一定的促进 作用;对ChB的活性有一定的抑制作用(Co2+除外)。随着底物壳聚糖脱乙酰 度的升高,ChA和ChB的活性均逐渐增强。采用纸层析和HPLC方法检测两种 壳聚糖酶的降解产物,确定ChA为内切酶,ChB为外切酶。 最后初步探索了以混合酶法和内切酶法分别降解制备相对分子质量为50 kDa的壳低聚糖。建立了以特性粘度法测试壳聚糖相对分子质量的标准曲线,如 MHS方程表述:[η]=3. 72×10-5Mw1. 37。以混合酶降解制备相对分子质量50 kDa的壳低聚糖方法简单操作容易,发酵50 h,产品收率达到70%。采用壳聚 糖内切酶ChA可以制备不同相对分子质量不含单糖的高纯度壳低聚糖产品。用 20 U的ChA酶溶液降解500 ml 4%的壳聚糖,20 h以内即可得到相对分子质量 50 kDa的产品,收率达到100%。


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