原发性肾病综合征患者Nephrin和Podocin及CD2AP基因表达变化的研究

【摘要】：研究背景 肾病综合征是常见的,严重威胁人类健康的慢性临床症候群,后天原发性肾病综合征居其中的绝大部分。大量蛋白尿是肾病综合征病人所有病理生理改变的基础,其发生可能与遗传背景、免疫异常及肾小球滤过膜异常等因素有关。肾病综合征发病的遗传因素研究在近年来有了很大的进展。 Nephrin是第一个被证实定位于SD的蛋白成分,是一种新的免疫球蛋白的超家族跨膜蛋白,分子量约135KD,含1241个氨基酸。Nephrin高度特异性地表达于肾小球上皮细胞足突间的SD上,人体其他组织仅大脑及胰腺有少量低度表达。 法国Antignae等2000年报道在家族性常染色体隐性遗传性局灶节段性肾小球硬化病例(FSGS)中发现了Podocin。其编码基因NPHS2的缺失可导致常染色体隐性遗传激素抵抗型肾病综合征,特征性地表现为儿童早期就出现的蛋白尿并迅速发展为终末期肾病。 CD2相关蛋白(CD2AP,CD2-associated protein),是1998年首次发现的一种分子量约80KD、富含SH3结构的连接蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员。其主要功能是通过SH3结构与CD2的结合,起到稳定T细胞与抗原呈递细胞的相互结合,从而使抗原递呈得以进行。但近年来的研究发现,CD2AP也是足 浙江大学博士学位论文 细胞分子之一,是维持肾小球滤过屏障生理完整性的重要成分。有众多动物实 验表明,CDZAP功能异常和/或基因突变与蛋白尿发生有关。 由于临床上原发性肾病综合征是最常见的,而先天性肾病综合征只占其中 的一小部分;而且,Nephrin是最早发现的、也是最重要的裂孔隔膜分子:Podocin 的变化可能与后天某些类型的肾病综合征发病密切相关;而CDZAP的临床研究 很少,同时CDZAP是一个免疫分子。所以,本研究拟以儿童原发性肾病综合征 患者为研究对象,采用聚合酶链反应(PCR)及测序技术分析Nephrin、Podocin 及CDZAP基因病人外周血淋巴细胞基因组DNA的序列变化;采用实时荧光定 量pCR技术(Qu田滋itative Real一time pCR)分析NePMn及CDZAP基因在病人 活检肾组织中mRNA水平的表达变化,采用间接免疫荧光、激光共聚焦显微镜 及免疫组化等方法分析NeP而n、Podocin及CDZ妙基因在病人活检肾组织中蛋 白质水平的表达变化,以探讨肾病综合征病人大量蛋白尿发生与NeP而n、 Podocin及CDZ妙基因突变及表达变化的关系,为探讨肾病综合征发病的遗传 背景与免疫紊乱的分子机制,为肾病综合征临床治疗提供理论依据及研究方向。 研究材料及方法 研究对象 以本院2002年1月一2005年4月就诊、入院的原发性肾病综合征病人为研 究对象。其中,60例原发性肾病综合征患者进行外周血淋巴细胞基因组DNA 中Nep而n、cDZ”基因突变和/或多态性变化;30例肾病综合征患者进行病人 活检肾组织中mRNA水平的表达变化分析;20例肾病综合征患者进行病人活检 肾组织中蛋白质水平的表达变化分析。上述病例发病时年龄均在1岁以上,排 除各类遗传性疾病的家族史,排除乙型肝炎病毒相关性肾炎、系统性红斑狼疮、 胰岛素依赖性糖尿病、系统性高血压等疾病史,排除其他各药物、理化因素引 起的肾脏病变导致的大量蛋白尿。 研究方法: 一、外周血淋巴细胞基因组DNA突变的分析 1、外周血淋巴细胞的分离 浙江大学博士学位论文 2、基因组DNA抽提 3、PCR反应 ①引物设计: ②PCR反应条件按文献适当修改。 4、电泳缓冲液及染色剂 5、电泳方法 6、测序 二、活检肾组织中Nep而n及CDZAP基因mRNA表达差异的分析 1、活检肾组织进行总RNA抽提 2、从mRNA一cDNA的逆转录过程: 3、质粒构建 质粒构建用以建立荧光定量PCR的标准曲线。引物由上海博亚公司合成。 (1)引物设计:各设计一对跨越数个内含子的引物。 (2)PCR初步扩增 (3)T-A克隆 4、荧光定量PCR (l)引物和探针设计:各设计一对引物跨越二个内含子。 (2)荧光定量PCR反应: 三、肾组织原位NePhrin、Podocin及CDZAP蛋白质水平表达变化的分析 1、间接免疫荧光法 2、激光共聚焦显微镜: 3、免疫组化方法 四、统计分析 患儿一般情况及肾组织CDZ妙和NeP而n的mRNA表达比较采用独立样 本t检验分析。采用两样本等级和检验(Mann一Whiiney Test)分析肾病患者及 单纯性血尿患者活检肾组织CDZ”、Podocin和Nep城n蛋白质表达变化。P0.05 认为差异具有统计学显著性意义。 浙江大学博士学位论文 研究结果 一、外周血淋巴细胞基因组DNA突变的分析 所有原发性肾病综合征病例中未发现严重的插入、缺失引起框架漂移或提 前终止等突变情况。 1、发现有NPHsl基因突变的原发性肾病综合征患者 ①外显子8和外显子9之间的内含子区域: 有纯合子也有杂合子,7906G~A:33#、51#、57#、65#、82#、91#、92#、93#、 98#共9个标本。 ②外显子8和外显子9之间的内含子区域:7892C一 T: 77#。 ③外显子11编码区:错义突变,杂合子,1358A一G,Q453R,72#。 ④外显子17编码区: 同义突变,杂合子,2223C一T,T74lT:1#、16#、34#、54#、76#、 83#、86#、88#共8个标本。 ⑤外显子17编码区:同义突变,纯合子,2289C一T,V763V:1#、11#、 16#、21#、27#、34#、54#、57#、60#、62#、70#、71#、76#、78#、 83#、86#、88#、92#共18个。这个突变在dbSNP已有报道。 ⑥外显子18