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靶向hTERT反义寡核苷酸对人舌鳞癌细胞增殖和端粒酶的抑制作用

姚华  
【摘要】:舌鳞状细胞癌是口腔最常见的恶性肿瘤,目前主要采取手术、化疗和放疗结合的综合治疗措施,仍存在不易根治的问题。随着分子生物学技术和人类基因组计划的不断发展,肿瘤的发生、发展被认为是在内外因素作用下,癌基因和抑癌基因失调,导致细胞失控性增殖的过程。针对癌基因或抑癌基因的基因治疗有望成为常规治疗的补充,用于消灭复发或残存的肿瘤细胞,在肿瘤领域的应用研究中取得了令人瞩目的成果。其中,以封闭和抑制特定基因表达为目的的反义寡核苷酸技术在肿瘤治疗方面显示了广阔的发展前景。 反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)技术,是近十几年兴起的一种生物高新技术,是指利用人工合成的反义RNA和DNA来阻断基因的转录或复制,特异性封闭有害基因,防止或阻断疾病相关蛋白的表达,以达到治疗某一疾病的目的。反义寡核苷酸还可以干扰mRNA的代谢,包括5’加帽、剪接、翻译起始及延长等。国内外学者利用反义寡核苷酸技术加快了癌细胞凋亡,己从实验室走进临床并取得一定成效。20世纪90年代以来,反义寡核苷酸技术用来治疗肝癌、卵巢癌等若干人类肿瘤已进入临床Ⅱ期试验,未见明显副作用。反义寡核苷酸技术被认为是最有希望运用于临床的基因治疗手段。目前,寻找良好的靶点仍是反义寡核苷酸技术的关键环节和难题。 浙江大学博士学位论文 近年来大量研究发现端粒酶是人体内最具肿瘤特异性和高表达的生物学标志,85%以 上的恶性肿瘤有端粒酶活性,而正常体细胞几乎未见其表达。它是由端粒酶RNA、端粒酶 逆转录酶(human telornerase reverse transeriptase,hTERT)基因和端粒酶相关蛋白构成的复 合体,以自身RNA为模板逆转录合成端粒重复序列(T TAGGG)n,维持端粒长度。深入研 究发现,hTERT与端粒酶活性平行,并决定端粒酶活性,是端粒酶激活的限速步骤。90% 以上恶性肿瘤有hTE盯转录,hTE盯比端粒酶RNA与恶性肿瘤更具相关性。用反义hTERT 导入肝癌细胞,白血病细胞等癌细胞后具有明显抑制生长及诱导凋亡作用;将高表达hTERT 癌细胞敲除hTERT mRNA后,细胞恶性表型出现逆转;正常细胞导入hTE盯后,细胞永 生化,经分裂数代后出现恶性生物学行为。这些证据表明,hTERT与癌的发生发展密切相 关,hTE盯己成为抗癌治疗的靶点。而国内外文献,尚未见有以hTE盯为靶点抑制舌鳞癌 的系统报道。 本研究通过实时荧光定量法检测口腔鳞癌组织中hTERTmRNA的表达情况,探讨 hTERT在口腔中表达的意义。以端粒酶逆转录酶基因作为分子靶点,设计一段与之互补的 反义寡核普酸序列,采用具有转染率高、毒性低的阳离子脂质体作介导,将hTERT反义寡 核普酸导入口腔鳞癌Tcas 113细胞,探讨其对细胞增殖、凋亡、细胞周期和端粒酶活性的 影响及机理。将经过hTERT反义寡核昔酸预处理的rcasll3细胞接种于裸鼠,观察Tcasll3 细胞裸鼠移植瘤成瘤时间、瘤重和端粒酶变化,了解hTERT反义寡核普酸在体内环境下对 Tcas 113细胞生物学行为的影响。通过上述系统研究,探讨以hTE盯为靶点开展抗舌癌研 究的可行性,为深入研究提供实验依据。 材料与方法 研究对象:新鲜口腔鳞癌及其手术切缘组织、正常口腔勃膜、人舌鳞状细胞癌Tcasll3 细胞株和BALB/C裸鼠 2研究方法: 采用实时荧光定量法检测新鲜口腔鳞癌及其手术切缘组织、正常口腔勃膜和Tcas 113 细胞中hTERTmRNA的表达情况。 浙江大学博士学位论文 2.2采用脂质体包裹法将反义寡核昔酸序列导入Tca81I3细胞,寡核昔酸终浓度为0.5林M、 1.郎M和2.0林M,同时设正义寡核昔酸、空载体和空白培养基为对照。 2.3倒置显微镜下观察Tcasll3细胞生长情况和形态变化,MTT法检测细胞增殖情况,流 式细胞术检测细胞周期和凋亡,ONA琼脂糖凝胶电泳法检测Tcas!13细胞的ONA!adder, TRAP一ELISA法和TRAP银染法检测细胞和移植瘤组织端粒酶活性,RT-PCR法分析 eyelinol、Bel一2和e一Mye mRNA的表达。采用Western blot检测Tcasll3细胞中hTE盯蛋 白表达量。HE染色法观察裸鼠移植瘤组织病理学表现,免疫组化法检测瘤体组织中细胞增 殖核抗原(proliferating eell nuelear antigen,PeNA)和Be一2的表达,裸鼠移植瘤组织中 hTE盯表达采用R下pCR方法检测。 3统计学方法: 采用sPSsl 1 .0统计软件进行处理。实验数据以均值士标准差表示,组间差异比较采用 t检验、ANOVA和Sludent一Ne、man一Keuls检验,尸005认为差异具有显著性意义。 结果 1口腔鳞癌组织中hTERT mRNA的表达 实时荧光定量法结果显示:口腔鳞癌组hTE阶’值(Mean士50)为34 1 9.97士2653.24 (拷贝数/2林L),明显高于口腔鳞癌切缘组织(297.50士3!2.40)和正常勃膜组(!31 .63士 258.33),尸0.05。鳞癌切缘组织和正常组织间hTERT mRNA的表达无统计学差异(P0.05)。 10%(10/30)口腔鳞癌组织、77.8%(23/30)鳞癌切缘组织和90%(9/10)正常口腔钻膜 hTERTmRNACt值35。不同分化程度口腔鳞癌组织hTERT mRNA的表达情况与临床病理 学分级无明显相关(P0.05),但显示出升高的趋势。说明hTERT在口腔鳞癌组织中特异 性高表达。 2反义寡核普酸对Tca8113细胞增殖的影响 0.25林M一1.邻M反义寡核普酸组Tcasll3细胞能够缓慢增殖,但48h后,反义寡核营酸 组细胞增


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