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番茄Cf-4和Cf-9基因介导的过敏性反应调控及基因沉默技术的研究

王长春  
【摘要】:基因对基因抗性是植物抗病性的重要表现形式。该抗性由植物抗病基因(resistance gene,R)和互补病原物无毒基因(avirulence gene,Avr)共同决定。R与Avr的互作通常导致过敏性坏死(hypersensitive response,HR)。番茄(Iycopersicon esculentum)与叶霉菌(Cladosporium fulvum)系统是研究基因对基因抗性的模式系统。该系统中多对R/Avr互补基因对,包括Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9,已被克隆。本论文研究内容包括两部分。第一部分,以番茄与叶霉菌系统为研究对象,对Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介导HR产生的特性进行研究。包括Cf-4和Cf-9启动子活性的比较,以及温度和湿度对Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介导的HR的影响。第二部分,应用于模式植物番茄和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)操作体系的优化和开发。所获主要结果如下: 1.明确了Cf-4和Cf-9基因启动子转录调节活性的差异。构建了Cf-4和Cf-9基因上游3 kb非编码区序列(简称pCf-4和pCf-9)分别与Cf-9和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)开放阅读框的嵌合结构pCf4∷Cf-9,pCf9∷Cf-9,pCf4∷GFP和pCf4∷GFP,以及由CaMV 35S启动子驱动的嵌合结构35S∷GFP.通过遗传转化,获取了上述五个结构的转基因烟草。将pCf4∷Cf-9和pCf9∷Cf-9转基因烟草与35S∷Avr9纯合烟草进行杂交,所获F_1群体中,约50%携带Cf-9/Avr9基因对。这些Cf-9/Avr9烟草在25℃萌发后迅速产生HR,最终死亡。通过比较发现,pCf4∷Cf-9/Avr9基因型和pCf9∷Cf-9/Avr9基因型烟草表现HR的强度,及其对发育的影响,和对温度的敏感性等方面均有显著差异。在25℃培养时,pCf9∷Cf9/Avr9烟草种子萌发后不脱种皮,子叶很小且不能正常展开,整苗鲜重轻,产生的HR显著强于pCf4∷Cf-9/Avr9烟草.然而在32℃条件下,两者HR产生均受到抑制,两种烟草苗的发育情况以及最终表现HR和死亡的时间均相似。通过对上述5个结构的转基因烟草的RT-PCR分析发现,pCf9∷Cf-9和pCf9∷GFP的转录本积累量高于pCf4∷Cf-9和pCf4∷GFP。以上结果说明,pCf9转录调节活性高于pCf4,而且对高温更敏感。


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