中华蜜蜂（Apis cerana）毒腺cDNA文库的构建及主要毒蛋白基因表达调控研究

【摘要】：蜜蜂的毒液是由蜜蜂毒腺分泌的多种组分的混合物,富含多种生物和药理活性物质,具有很大的应用前景。蜜蜂主要用它来防御其他动物的入侵和危害。中华蜜蜂是我国特有的蜜蜂资源,长期适应于我国的地理特征和气候条件,在我国年均饲养量约200—300万群,约占总饲养蜂群的三分之一,具有其他蜜蜂种类不可替代的应用价值和资源优势。但其基础研究落后,资源的利用方式十分原始和简单。蜂毒是中华蜜蜂开发利用的重要方面,我们已经对中华蜜蜂毒液内几种主要毒蛋白的基因进行了克隆和体外表达。在此基础上,为全面研究中华蜜蜂毒蛋白的组成和表达情况,本研究构建了中华蜜蜂毒腺cDNA文库,以期从中找出一些对人类健康有重要意义的生理活性蛋白或多肽;同时对溶血肽和磷脂酶A2在蜜蜂体内的表达从基因的拷贝数、转录/转录后水平以及蛋白表达水平三个方面综合进行研究,取得了一些进展,丰富了蜜蜂毒蛋白分泌生物学研究的内容。 两种蜜蜂毒液的双向电泳分析和中华蜜蜂毒腺cDNA文库的构建和EST分析 分别制备中华蜜蜂和意大利蜜蜂的毒液,在相同的条件下进行双向电泳分析,结果表明两种蜜蜂毒液之间只有82个组分是完全相同的,其他高达400左右的组分是不同的,两种蜜蜂毒液之间存在着巨大的差异。为进一步研究这种差异,解剖分离中华蜜蜂的毒腺,Trizol法提取总RNA,从中分离带有Poly(A)尾的mRNA,利用cDNA文库构建试剂盒构建中华蜜蜂毒腺的cDNA文库,经检测该文库滴度为5×10~6。在辅助噬菌体的帮助下,将该噬菌体文库转化成嗜菌粒文库。转化后的嗜菌粒文库的单个克隆用载体上的通用引物M13+和M13-PCR扩增所插入的片段,经凝胶电泳初步检测所插入片段的大小,选送插入片段大小不同的克隆进行测序。筛选出了蜜蜂的主要毒蛋白基因的克隆(磷脂酶A2、溶血肽、肥大细胞脱粒肽、明肽和镇静肽)和一批有研究价值的中华蜜蜂的特有基因(肌动蛋白、双链核酸内切酶、磷酸甘油变位酶、谷胱苷肽氧化酶、精氨酸激酶、气味结合蛋白、泛素等等),为后续的中华蜜蜂相关基因的研究提供一个平台和基础。 蜜蜂毒腺溶血肽(melittin)基因表达的研究 溶血肽是蜜蜂毒液内的最主要组分,占蜂毒干物质的50%左右,具有重要的生理药理活性。从中华蜜蜂毒腺cDNA文库筛选得到溶血肽基因克隆,基因cDNA序列全长389bp,其中5’-非编码区47bp,编码区213bp,3’—非编码区129bp。在3’-非编码区没有发现典型的多聚腺苷酸加尾信号,编码区的碱基序列与意大利蜜蜂的溶血肽cDNA序列有93%的一致性。推测的氨基酸序列也有相同的一致性,只有三个氨基酸残基不同,