稻瘟病菌MGTA1基因的克隆与功能分析

【摘要】：稻瘟病菌Magnaporthe grisea引起水稻的重要病害——稻瘟病,了解其致病分子机制对稻瘟病的防治意义重大。同时,作为丝状真菌致病机理与分子生物学研究的模式,M.grisea重要功能基因的克隆对了解其他病原真菌与寄主的互作也具有重要意义。M.grisea的侵入前过程,特别是附着胞的分化与形成,已经有很好的研究基础:而侵入后病菌的定殖、菌丝的分化和扩展等过程的机制却不够清楚。M.grisea刚刚侵入时,是病菌与寄主细胞建立和巩固寄生关系,获得营养以完成生活史的关键时期,了解该过程的分子机制是目前M.grisea致病机理研究的重点。豆类炭疽菌(Colletotrichum lindemuthianum)是另一种重要的植物病原真菌,与M.grisea同为附着胞介导侵入的子囊菌。二者侵入的前期过程(包括孢子萌发、附着胞分化等)很相似,调控这些过程的部分功能基因存在同源性(如CMKl与PMKl)。CLTAl是参与C.lindemuthianum侵入后菌丝分化与扩展的关键基因,ACLTAl突变子无法进行次生菌丝的分化,失去致病性。明确M.grisea中是否存在CLTAl的同源基因调控侵入后侵染菌丝的分化与扩展,有助于深入理解M.grisea菌丝扩展的分子机制及M.grisea与C.lindemuthianum侵入后过程的异同。本文克隆了CLTTAl在M.grisea中的序列同源基因MGTAl,并通过构建GFP融合蛋白研究了该基因的时空表达,通过基因取代的方法分析了MGJTAl基因在M.grisea致病及相关过程中的作用。研究结果如下: 1.利用CLTAl基因氨基酸序列在M.grisea基因组数据库中检索,获得序列相似(51%相似性)基因,定名为MGTAl。通过PCR获得了MGTAl基因的DNA克隆与cDNA克隆。通过序列测定,获得了包括启动子区和完整阅读框在内5.2kb的MGTA/基因全长。序列分析表明MGTAl开放阅读框长度为2773bp,包含6个外显子、5个内含子,编码区总长度为2370bp,编码790氨基酸残基的多肽。蛋白序列的特征分析发现MGZAl包含Zn(Ⅱ)2Cys6蛋白的三个保守结构(Zn(Ⅱ)2Cys6区、中部同源区与转录激活区)及二聚化因子区域,初步表明该MGTTAl为Zn[Ⅱ]2Cys6家族转录激活因子。 2.通过southern分析,明确了MGTTAl在Guyll及其他6种不同M.grisea菌株基因组中均为单拷贝。 3.MGTAl启动子与绿色荧光蛋白(eGFP)融合表达及RT-PCR实验表明,MGTAl