烟草赤星病拮抗细菌筛选及其16S rDNA PCR-RFLP分析

【摘要】：烟草赤星病是烟草的一类重要叶部病害,其主要病原菌为链格孢属真菌(Alternaria alterrrata (Fties) Keisslar),在烟草成熟后期危害十分严重,造成重大经济损失。目前防治烟草赤星病的化学药剂对环境和烟叶的污染日益严重,采用生物防治势在必行。本论文通过拮抗细菌的分离、平皿拮抗试验进行了拮抗菌的筛选研究,为此病害的生物防治奠定了基础。 本研究通过平皿拮抗试验分离测定了2,846株细菌菌株对烟草赤星病的离体防治效果。在平皿拮抗试验中,筛选得到B2、B4等22个对烟草赤星病表现出较强拮抗作用的菌株,B1、B3等114个菌株则对烟草赤星病表现出一定的拮抗作用。 上述136株拮抗赤星病的菌株经过16S rDNA PCR—RFLP分析,结果表明这些菌株具有遗传多样性,归于3个系统发育分支。通过对B2、B4、B39、B44、B45、B58、B84、B98、B108、B109、B120等11株拮抗菌进行16S rDNA全序列测定分析,结果表明1l株拮抗茵可以分为3个类群。16S rDNA分类结果和16S rDNA PCR—RFLP分析结果一致,但在个别菌株的归群上也存在一些差异。 菌株B75在温室盆栽测定和大田防效试验中,对烟草赤星病都有显著防效。因此利用传统的形态学特征观察B75的特征,发现此菌株革兰氏反应呈阳性,在NA培养基平皿上菌落呈土黄色,近圆形,表面干燥、起皱、不透明。进一步对葡萄糖产酸等10个生理生化指标进行测定,并结合形态学观察结果,初步鉴定B75菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对菌株B75进行16S rDNA全序列分析,测序结果在GenBank中进行Blast同源序列检索,利用DNAStar软件与芽孢杆菌属的其它种进行同源性比对。结果表明B75与已报道的B. subtilis 16SrDNA序列(登录号:AY030331)有100%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支。结合形态学特征、生理生化特征及16S rDNA全序列分析,确定菌株B75为B. subtilis的一个菌株。