减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗构建、表达及对草鱼生长影响研究

【摘要】：生长抑素(SS)是由下丘脑释放并作用于生长激素的14肽激素,具有激素和神经递质的双重作用,对SS进行免疫可促进生长类激素释放和提高动物生长速度。但由于SS肽链短而免疫原性较弱,需要同其他载体蛋白连接以增强免疫原性。 随着集约化鱼类养殖业的发展,鱼用疫苗的研究和开发逐渐得到重视,但注射免疫不适于DNA疫苗在规模化鱼类养殖中的推广应用。重组减毒细胞内细菌可作为载体将DNA疫苗递入动物体内,并能激发体液和细胞免疫反应。 本试验将生长抑素基因(SS)同乙肝表面抗原基因(HBsAg)连接,克隆入载体pUC18中,经PCR、酶切和测序分析,重组克隆载体pUC18-HBSS基因已按照设计插入到HBsAg基因3’端的223氨基酸处;进一步将HBSS基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1构建重组原核表达载体pGEX-HBSS并转化大肠杆菌E. coli BL21,含pGEX-HBSS的重组E. coli BL21在37℃经IPTG诱导表达4h,目的蛋白表达量约为细菌总蛋白20%;表达产物经过SS放射免疫法测定表明具有SS活性。 将HBSS基因克隆入的真核表达质粒pcDNA3构建重组质粒pcDNA3-HBSS,重组质粒通过高压电转化入减毒沙门氏菌Salmonella typhimurium ZJ111(dam~- and phop~-)(简称ZJ111/pcDNA3-HBSS,下同),通过PCR、酶切检测表明重组减毒沙门氏菌构建成功,在Amp~+和Amp~-的平板上培养10代表明重组质粒在沙门氏菌中较为稳定。将重组沙门氏菌转染HeLa细胞48h,从细胞中提取总RNA经RT-PCR检测发现,HBSS基因能在细胞中转录出RNA;转染72h后,SDS-PAGE检测到有目的蛋白表达;放射免疫测定表明,转染含pcDNA3-HBSS质粒的重组减毒沙门氏菌的细胞培养物裂解上清液中含SS 1.363μg/mL,HBSS基因在HeLa细胞中得到了表达,并具有较高的活性。 将ZJ111/pcDNA3-SS灌服草鱼,检验其侵袭力和侵入草鱼体内过程中质粒的稳定性。给幼草鱼灌服10~8cfu/ml、10~9cfu/ml、10~(10)cfu/ml的ZJ111/pcDNA3-SS以检验其对鱼的安全性,另设野生型鼠伤寒沙门氏菌(10~9cfu/ml)和PBS对照组,试验期20天,观察并比较各组死亡率。另取150克左右的草鱼灌服PBS、10~8cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS和10~8cfu/ml野生型鼠伤寒沙门氏菌组,7天后屠宰取肝和脾脏,做透射电镜切片观察。结果显示,对草鱼肝脏和脾脏分离菌的生化和特异性PCR鉴定表明,ZJ111/pcDNA3-HBSS能侵入草鱼体内;灌服7天后草鱼肝、脾脏分离的减毒菌抽提重组质粒进行PCR和酶切鉴定表明,减毒菌中的重组质粒在草鱼体内有较好的稳定性;灌服10~9cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS的幼鱼在试验期间有2尾死亡,10~8cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS和PBS的幼鱼采食和生长正常,灌服10~(10)cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS和野生型S. typhimurium的幼鱼死亡率分别为26.67%、76.67%。灌服10~8cfu/ml ZJ111/DcDNA3-HBSS的草鱼肝、脾细胞形态正常,肝脏线粒体略微