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热纤维梭菌β-葡聚糖酶热稳定性机制的研究

李卫芬  
【摘要】:β-葡聚糖酶是重要的饲用酶制剂,它能特异性地降解β-葡聚糖中与β-1,3键相邻的β-1,4键,从而可消除由β-葡聚糖引起的抗营养作用。β-葡聚糖酶主要来源于微生物,其中热纤维梭菌β-葡聚糖酶有较高的热稳定性,耐热温度可达80℃。因此,本研究通过基因缺失、突变及构建杂合基因等方法系统地研究了热纤维梭菌β-葡聚糖酶的耐热机制,主要研究内容和结果如下: (1) 构建和表达了热纤维梭菌β-葡聚糖酶成熟肽(licMB)及其2个缺失酶(LicMB△238-305 and LicMB△217-305)。LicMB△238-305为licMB在C-末端缺失了锚定结构域(dockerin domain,68个氨基酸残基组成)的缺失酶;LicMB△217-305为同时缺失了连接子(Thr-Pro-box,21个氨基酸残基组成)和锚定结构域(dockerin domain)的缺失酶。酶特性研究表明:LicMB△238-305和LicMB△217-305的比活分别比LicMB高90.58%和36.65%;75℃处理10min,LicMB△238-305、LicMB和LicB△217-305的残余酶活力分别为100%、86.05%和79.09%,LicMB△238-305的热稳定性高于licMB和LicMB△217-305。以上结果说明热纤维梭菌β-葡聚糖酶锚定结构域的存在会降低酶活力和热稳定性,而连接子的存在会提高酶活力和热稳定性,这二个区域对酶的作用相互抵消。因此,热纤维梭菌β-葡聚糖酶成熟肽的热稳定性与其结构域相当,即热纤维梭菌β-葡聚糖酶的热稳定性与其C-末端尾巴无关,而与其催化结构域有关。 (2) 以LicMB-CD(热纤维梭菌β-葡聚糖酶催化结构域)为材料,构建和表达了7个N-末端缺失和3个C-末端缺失的LicMB-CD缺失酶。7个N-末端缺失酶定名为LicMB-CD△N3、LicMB-CD△N5、LicMB-CD△N7和LicMB-CD△N9、LicMB-CD△N11、LicMB-CD△N13和LicMB-CD△N25,分别在N-末端缺失3、5、7、9、11、13和25个氨基酸残基;3个C-末端缺失酶定名为LicMB-CD△C3、LicMB-CD△C6和LicMB-CD△C9,分别在C-末端缺失3、6和9个氨基酸残基。研究结果发现:与亲本酶(LicMB-CD)相比,LicMB-CD△N3、LicMB-CD△N5、LicMB-CD△N7和LicMB-CD△N9热稳定性都有不同程度的下降,70℃处理10min,残余酶活力均在70%以上;75℃处理10min,LicMB-CD(亲本酶)、LicMB-CD△N3、


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