收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

β-1,4-半乳糖基转移酶在毕赤酵母中的克隆、表达及活性测定

金慧  
【摘要】:β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase,β-1,4-GT)是一种Ⅱ型膜结合糖蛋白,通常认为是一种管家基因产物,是至今研究最多的糖基转移酶之一。β-1,4-GT利用尿苷二磷酸半乳糖(UDP-galactose,UDP-Gal)作为激活的糖供体,把半乳糖转移到N-多糖复合物末端的N-乙酰基葡萄糖胺上。它不仅存在高尔基体上,而且整合于细胞质膜上,并表现不同的生物学功能。 巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间和胞内型蛋白质。该系统具有细胞繁殖快、培养条件廉价、遗传操作简单、易于工业化生产等原核表达系统的特点,又具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力,避免了包涵体变性、复性,及复性后产物活性低甚至无生物学活性等问题,非常有利于真核基因的表达。 本文采用降落PCR技术,以含有β-1,4-GT基因的pGEX-4T-2质粒为模板对β-1,4-GT基因进行克隆改造,测定了克隆获得的DNA片段,与已知的基因序列一致。将克隆获得基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和Not Ⅰ之间,构建了重组分泌表达质粒pPIC9K-GT。应用电穿孔法将线性化的重组表达质粒转入宿主感受态细胞GS115,经筛选获得β-1,4-GT多拷贝整合酵母工程菌Pochia pastoris GS115。在0.5%(v/v)甲醇诱导下,工程菌Pochia pastoris GS115成功分泌了β-1,4-GT。将SDS-PAGE蛋白电泳进行密度扫描,显示β-1,4-GT占总分泌蛋白的35%。用Sephadex G-75凝胶过滤来纯化分泌蛋白,最终得率为92mg/L。将在1分钟内能转化1nmol底物所需的酶量定义为一个酶活力单位。利用苯酚红会随H~+浓度改变在557nm光密度值变化的特点,测定β-1,4-GT的酶活为98.6U,酶的比活力为21.43U/mg。同时对胞外分泌和胞内蛋白的酶活进行了比较。 我们的研究为日后对β-1,4-GT进行更广泛深入的研究,以及工业化生产有活性的β-1,4-GT奠定了基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 孙明,赵红玲,王丽春,王炯,和绍清,李琦涵;血管生成抑制素K1~3环结构体酵母表达及活性检测[J];中国生化药物杂志;2001年02期
2 张旭,黄秉仁,蔡良琬;红细胞生成素基因克隆及其在酵母细胞中的表达[J];中国医学科学院学报;1997年05期
3 王剑霓;酵母表达的普马拉汉坦病毒核壳蛋白在欧癭模型中诱导保护作用[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2003年06期
4 刘文,胡巍;酵母表达基因工程产物特性分析[J];生物工程进展;2001年02期
5 金俊琰;周莉;桂建芳;;石斑鱼β-防御素的酵母表达及其产物抗菌活性分析[J];水生生物学报;2011年05期
6 宋钢,官孝群,宋后燕;人微小纤溶酶原基因在甲醇营养型酵母中的表达[J];生物工程学报;1999年02期
7 王艾平;粟永萍;申明强;王崧;程天民;王军平;;人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究[J];第三军医大学学报;2008年04期
8 涂宣林,朱运松,宋后燕;t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达[J];生物工程学报;1998年04期
9 沈俊卿,屈贤铭,田昱;抗菌肽ABP3基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达[J];生物工程学报;1999年04期
10 王留强;班巧英;贺琳;王玉成;;二色补血草LbDREB基因在酵母中的抗逆性分析[J];植物生理学报;2011年04期
11 孙国凤;;用酵母表达金枪鱼生长激素[J];生物技术通报;1990年11期
12 田昱,李平,朱运松;人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达[J];中国生物化学与分子生物学报;1998年03期
13 宋钢,官孝群,莫炜,宋后燕;人微小纤溶酶原活性中心丝氨酸突变体基因在毕赤酵母中的表达[J];药物生物技术;2000年04期
14 何葆光;黄培仁;李育阳;诸慧嘉;郎文华;吴国泰;戴耀勋;黎志豪;;乙型肝炎表面抗原基因在酵母中的表达[J];生物工程学报;1985年01期
15 刘一平,杨晓,徐晓玲,邓继先,程萱,黄翠芬;SMAD4在嗜甲醇酵母中的表达及鉴定[J];生物化学与生物物理学报;2000年03期
16 乔红伟;韩俊友;赵瑞利;胡博;谢芳;郑伟;雷连成;江利娜;韩文瑜;;中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测[J];中国兽医学报;2008年06期
17 严琳,顾贫,陈焕春;猪白细胞介素-6在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达[J];微生物学报;2005年03期
18 王黎;刘洋;陈敏;;酵母表达人源化糖蛋白研究进展[J];中国生物工程杂志;2007年04期
19 李斐;李鹏;郑其升;于春梅;陈溥言;;猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域间接ELISA方法的建立[J];中国生物工程杂志;2007年09期
20 张烨;于在江;辛丽;陈永坤;唐启慧;陈禹保;陈清轩;舒跃龙;;流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在酵母菌中的表达[J];生物工程学报;2010年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈定虎;王锡锋;李莉;周广和;;酵母表达美洲商陆抗病毒蛋白的活性检测[A];中国植物病理学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2002年
2 李如冰;;Pichia酵母表达重组人可溶性TRAIL的纯化与生物活性[A];2004年全国生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
3 刘健;陈瑞爱;朱杰仪;唐明森;罗满林;;猪干扰素-α基因经密码子改造在毕赤酵母菌中的高效分泌表达[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
4 程相朝;刘一尘;张春杰;李银聚;吴庭才;程安春;;HN-ChMIL18融合基因毕赤酵母表达条件的优化与生物活性的检测[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
5 李小杰;唐玉林;郑易之;;基于酵母表达体系的大豆SALI3-2蛋白耐盐功能鉴定及结构域研究[A];2007中国植物生理学会全国学术会议论文摘要汇编[C];2007年
6 张淑琼;曾思遥;高娟;陈瑞爱;罗满林;;犬IFN-α优化基因的真核表达及抗病毒活性的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
7 张忠芳;高士争;李士泽;张玉静;;猪瘦蛋白基因在毕赤酵母中的表达[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
8 王战勇;王志玉;;酵母表达的HSV-I重组gD在ELISA诊断中的初步应用[A];山东预防医学会首届学术年会资料汇编[C];2003年
9 张意;陈国友;王建莉;于益芝;蒋应明;卢琳;曹雪涛;;酵母表达的MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的双重生物学功能及相关机制研究[A];第九届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2006年
10 单彩凤;王建莉;;CXCL14/GM-CSF酵母表达融合蛋白的制备和纯化[A];浙江省免疫学会第六次学术研讨会论文汇编[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王衡馨;酵母Yca1是一个钙离子依赖的偏赖氨酸—半胱氨酸蛋白酶[D];清华大学;2012年
2 任雪艳;重组酵母GS115/PSD,GS115/CEC的构建及其对水果采后病害抑制效果的研究[D];浙江大学;2012年
3 徐凯;通过体外DNA改组技术获得新的植物强耐盐Na~+/H~+逆向转运蛋白基因[D];华东师范大学;2010年
4 胡巍;丙型肝炎病毒NS3蛋白酶及抑制肽研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
5 张润祥;重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究[D];东北农业大学;2013年
6 孙熙麟;毕赤酵母表达重组蛋白生产工艺关键技术及其机制研究[D];吉林大学;2014年
7 张艳宇;人层粘连蛋白α4链LG1-3组件的研究[D];中国人民解放军军需大学;2003年
8 赵海艳;蛋白激酶C对PRRSV感染的影响以及GP5重组乳酸克鲁维酵母免疫效果的初步研究[D];中国农业大学;2014年
9 林萍;中间锦鸡儿油酸脱氢酶(FAD2)基因克隆及酵母表达调控的研究[D];中国林业科学研究院;2008年
10 黄圣兵;大鼠肝线粒体胆碱脱氢酶与电子传递黄素蛋白—泛醌氧化还原酶的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 庄世文;食源酵母分离株风味物质及其三种酯代谢酶基因的分析[D];天津大学;2010年
2 章英;柑橘采后生防菌柠檬形克勒克酵母(34-9)遗传转化体系的建立[D];华中农业大学;2012年
3 张鲁滨;重组猪α干扰素的酵母表达及其对病毒的抑制作用[D];甘肃农业大学;2012年
4 刘伟;转坛紫菜hsp70酵母的生理生化研究[D];宁波大学;2012年
5 杨静;转萝卜过氧化物酶基因RsPrx1酵母表达条件优化及其抗性机理研究[D];河南师范大学;2011年
6 王德;补骨脂抗菌蛋白PscAFP的酵母表达及转基因烟草抗病性分析[D];西南大学;2010年
7 杨涵江;MSTN基因克隆、表达及其主动免疫研究[D];西北农林科技大学;2011年
8 冯伊琳;单环刺螠纤溶酶Ⅱ基因的克隆及其在酵母中的表达[D];中国海洋大学;2011年
9 单喆;星星草PutCAX2在酵母中表达的功能解析[D];东北林业大学;2012年
10 匡野;通过优化Kex2 P1’位点在毕赤酵母中高效表达重组蛋白SCF[D];吉林大学;2014年
中国重要报纸全文数据库 前5条
1 东北证券金融与产业研究所 聂昕;天坛生物:财务风险加大[N];中国经营报;2002年
2 智卫真;华药:用“魅力”抢滩乙肝免疫市场[N];医药经济报;2005年
3 李瑶;HPV疫苗前景可期[N];医药经济报;2008年
4 华泰证券投资策略部 任飞;天坛生物:年报业绩乏善可陈[N];医药经济报;2002年
5 建明;医药上市公司谁领风骚[N];中国经营报;2000年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978