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人肺癌单链抗体库的构建、筛选及其抗体结构与功能的研究

晏向华  
【摘要】:肺癌居癌症致死之首,非小细胞肺癌患者约占肺癌患者总数的80%。绝大多数非小细胞肺癌患者处于不可动手术阶段。目前治疗非小细胞肺癌的策略有化疗、手术治疗和放疗,但大多数患者易复发从而导致死亡。随着肿瘤细胞生物学的研究深入,出现了分子靶向治疗模式。在非小细胞肺癌细胞中发现了血管内皮生长因子受体2表达量的变化,血管内皮生长因子受体2及其配体的过度表达是肺癌一个重要特征。因此,血管内皮生长因子受体2成为一个非常有吸引力的治疗靶点。随着抗血管生成药物的发展,时至今日,大量的研究工作聚集于开发抗血管内皮生长因子受体抗体,特别是人源单链抗体的研制。 目前有几种展示系统可以用于生产人源抗体,例如噬菌体展示、细胞表面展示、核糖体展示和mRNA展示。这些方法的主要原理是在筛选过程中将基因型和表型连接起来。体内法主要受以下一种或几种因素而影响筛选效率:①不能在不同的细胞环境下进行筛选;②不能对对细胞有毒性的蛋白进行筛选;③细胞循环筛选压力;④较低的转化效率。而核糖体展示完全在体外进行筛选,它克服了上述不利因素。通过在体外翻译系统(Escherichia coli S30或rabbit reticulocyte)中形成抗体-核糖体-mRNA复合物(ARM),各抗体将与它们相应的mRNA,利用抗体结合反应的功能特性进行筛选,筛选到的mRNA可以通过RT-PCR进行扩增与回收或下一轮筛选、突变和克隆步骤。本研究的目的是构建肺癌人源单链抗体库并运用核糖体展示技术对其进行筛选,获得的主要研究结果如下: 我们从30名肺癌患者志愿者抽取血样,进行淋巴细胞的分离和总RNA的提取,通过PCR技术扩增人全套重链可变区基因和轻链可变区基因,并对它们进行拼接,连接肽为GSASAPTLFPLVS。全长单链抗体基因包括一个T7启动子和一个翻译起始序列(Kozak序列)。所构建的人源单链抗体库的库容量为7.6×10~(13),经DNA fingerprinting和测序分析33个阳性重组子的序列,我们发现该抗体库具有丰富的多样性。我们选取人血管内皮生长因子受体2作为目标抗原对该单链抗体库进行核糖体展示筛选研究。经过三轮筛选,我们成功地获得了anti-VEGFR-2单链抗体基因。随后经双酶切技术将anti-VEGFR-2单链抗体基因连入表达载体(pET-30(a)+)并转化E. coli BL21进行表达。在LB培养基中37℃培养12小时,经IPTG诱导表达6小时,收获菌体,经SDS-PAGE分析,Anti-VEGFR-2单链抗体的分子质量为31kDa,表达量占总体蛋白的27%。经亲和层析法纯化的Anti-VEGFR-2单链抗体的亲和常数为1.3×10~9L/mol,抗体效价为1:3200。Anti-VEGFR-2单链抗体序列经软件DNA-PLOT分析后发现该抗体的重链可变区属于V_(H3)亚群,轻链可变区属于V_(κⅢ)


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