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双重组菌耦合不对称还原生产(R)-或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究

敬科举  
【摘要】:手性化合物由于其特殊的生物活性,已经在医药、农药、材料、香精香料及昆虫信息素和激素等方面得到广泛的应用。近年来,用手性技术不对称催化合成手性化合物及其手性中间体已经引起了学术界和企业界的重视,成为研究开发的热点。利用微生物酶不对称催化具有反应条件温和、转化率高及立体选择性好等优点,已经成了诸多手性合成方法的首选。本文将以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)作为β-羰基酯还原的模型底物,利用基因工程技术构建的重组大肠杆菌分别表达单一醛基还原酶和羰基还原酶,研究用这两个重组菌分别催化COBE不对称还原为相应R-或S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)的反应规律。为了解决辅酶再生的问题,构建了表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌作为还原型辅酶NADPH的再生系统,研究了分别与上述两个重组菌耦合催化4-氯乙酰乙酸乙酯还原反应的特性。 研究工作的主要进展包括: 一、从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor ZJU 010)细胞中克隆得到了醛基还原酶(NADPH-dependent aldehyde reductase,ALR)基因,构建了含ALR基因的表达质粒并转化到大肠杆菌中。通过筛选,获得高效表达醛基还原酶的重组菌E.coli M15(pQE30-ALR),经培养和诱导条件优化,该重组菌的比酶活提高到7.28 U/mg,比酶活比原始菌株高14倍。在水相反应体系中,选用COBE作为模型底物,重组菌E.coli M15(pQE30-ALR)能够催化COBE不对称还原为纯手性的R-CHBE,e.e.值高达100%,产率为98.5%;而利用赭色掷孢酵母催化的产物产率和e.e.值分别只有64.5%和63.5%。成功地解决了用酵母细胞催化COBE还原时产物e.e.较低的问题。考察了辅酶及共底物、底物和产物浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对反应的影响。结果表明,由重组菌催化的不对称还原必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及辅底物葡萄糖的参与下才能进行;底物和高浓度的产物对还原反应有抑制作用;当pH6.0时,反应的转化率及产率都会显著降低;高密度重组细胞可以减少底物的抑制作用;通过分批加入底物的方式可以有效缓解水相体系底物的抑制,产物浓度可达90mmol/L。 二、为了解决重组菌M15(pQE30-ALR)催化还原反应中还原型辅酶NADPH不足的问题,分别从巨大芽孢杆菌B.megaterium AS1.223和B.megaterium AS1.151中克隆到了两个葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH)基因gdh151和gdh223,并构建了重组菌E.coli M15(pQE30-gdh223)和M15(pQE30-gdh151)。对这两个重组菌进行诱导表达,结果发现前者的GDH比酶活是后者的11倍。对两个葡萄糖脱氢酶氨基酸序列分析结果发现,GDH223与GDH151仅有一个


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