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5-氨基乙酰丙酸合成酶基因的克隆表达及生物合成5-氨基乙酰丙酸的研究

刘晓侠  
【摘要】:5-氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid,ALA),是四吡咯类化合物(例如:亚铁血红素、卟啉、叶绿素和维生素B_(12))的共同前体,也是调节四吡咯类物质生物合成的关键代谢中间物,广泛存在于微生物、植物和动物细胞中。近年来,发现ALA在农业上可用作杀虫剂、除草剂及生长调节因子;在医学领域,ALA作为第二代光动力药物,可用于治疗各种癌症,例如:皮肤癌、口腔癌、十二指肠癌、胰腺癌和膀胱癌等。因此对ALA的工业化生产引起了学术界和产业界的重视。 本文从微生物中克隆得到了ALA合成酶基因,构建了高产5-氨基乙酰丙酸的工程菌,通过对工程菌培养条件的优化,大幅度提高了ALA的产量。 研究工作的主要创新点和进展包括: 1) 分别从放射形土壤杆菌(Agrobacterium bacterium zju-0121)和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)细胞中克隆得到了5-氨基乙酰丙酸合成酶(5-aminolevulinic acid synthase,ALAS)hemA基因,通过对基因的序列分析,发现来自放射形土壤杆菌的hemA基因属于一个新的基因,而来自类球红细菌的hemA基因第335位的氨基酸发生了突变。 2) 分别构建了含放射形土壤杆菌和类球红细菌hemA基因的多个表达质粒并转化到大肠杆菌中。通过对胞外5-氨基乙酰丙酸产量和5-氨基乙酰丙酸合成酶的比活力进行比较,发现用来源于放射形土壤杆菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因所构建的重组菌E.coli BL21(DE3)(pET28-A.R-hemA)具有最高的ALA产量和ALAS活力。 3) 研究了重组菌E coli BL21(DE3)(pET28-A.R-hemA)的摇瓶发酵条件。考察了初始葡萄糖浓度、溶氧、温度、前体及抑制剂对重组菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸的影响,确定了最佳的诱导条件和培养条件。在最适发酵条件下,重组菌E.coliBL21(DE3)(pET28-A.R-hemA)摇瓶发酵的5-氨基乙酰丙酸的产量可达1.3g/L,比优化前(没加前体)提高了16.2倍。 4) 利用5L的发酵罐进行工程菌培养生产5-氨基乙酰丙酸的研究,对影响产物产量的因素,如:初始葡萄糖浓度、溶氧、pH值、培养方式进行了考察,在优化条件下,发酵罐中的5-氨基乙酰丙酸的产量可达到3.1g/L,比摇瓶发酵提高了238.5%。以5L发酵罐分批发酵的实验数据为依据,对5-氨基乙酰丙酸发酵动力学进行了研究,分别建立了菌体生长、底物消耗和产物生产的非结构模型。该模型能较好的反映5-氨基乙酰丙酸的分批发酵过程。 5) 针对目标产物ALA非蛋白质,外源基因所表达的产物ALA合成酶只是催化ALA合成的催化剂的特点,提出了基因工程菌培养时必需提高产量酶的催化活性而不是翻译得到的更多蛋白质的观点,并采用了较弱的诱导剂乳糖代替价格昂贵而且有毒的强诱导剂异丙基-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)的新方法进行ALA合成酶的诱导表达。在发酵罐分批培养中,胞外5-氨基乙酰丙酸的产量和ALA合成酶的比活力分别提高了43%和15%。 6) 为了有利于ALA的分离和降低生产成本,采用了以D-葡萄糖代替乙酰丙酸作为ALA脱水酶的抑制剂的方法,通过合适的流加策略使胞外ALA的产量提高到了3.1g/L。


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