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和厚朴酚诱导人白血病HL60细胞系产生线粒体相关程序性死亡的研究

顾颖  
【摘要】:和厚朴酚是从天然植物厚朴中提取的单体成分,已知其有多种药学作用,并且能诱导某些人类肿瘤细胞凋亡,但对其引发非凋亡类程序性死亡的研究,至今还无文献报道。本论文旨在通过对和厚朴酚诱导HL60细胞产生死亡的研究,部分明确这种非凋亡的程序性死亡模式及调控机理。主要研究内容如下: 1.和厚朴酚抑制HL60细胞生长,其细胞毒性呈剂量及时间依赖性 MTT实验结果显示,和厚朴酚对HL60细胞毒性呈浓度依赖性,导致半数死亡的药物浓度(IC50)约是13.47μg/ml。一定浓度和厚朴酚作用不同时间后,乳酸脱氢酶法检测细胞死亡率,死亡比例呈时间依赖性升高。 2.和厚朴酚诱导HL60产生的死亡过程不依赖于caspase激活 50μM caspase总抑制剂zVAD-FMK与15μg/ml和厚朴酚联合处理HL60细胞12小时后,PI检测细胞死亡率。加入zVAD-FMK后细胞死亡率为44.95%±3.63%,较和厚朴酚单药组(53.01%±3.52%)无显著差异(p0.05),zVAD-FMK无显著抑制效果。此外,15μg/ml和厚朴酚处理HL60细胞6,12,24小时后,试剂盒检测caspase-3活性,与正常对照组比值分别为:1.24±0.04,1.59±0.30,1.37±0.19,与对照组相比均无显著增高(p0.05),caspase-3无激活。 3.和厚朴酚诱导HL60死亡过程中不引起AIF转位 免疫荧光反应进行AIF转位实验。激光共聚焦显微镜拍照结果显示,15μg/ml和厚朴酚处理HL60细胞12小时后,AIF蛋白荧光区域与细胞核荧光区域无交叠,AIF蛋白没有出现转位。 4.和厚朴酚对HL60细胞周期无明显影响,DNA电泳也不出现梯带化 15μg/ml和厚朴酚作用HL60细胞12小时,流式细胞仪检测,未出现明显的周期变化及亚二倍体凋亡峰。15μg/ml和厚朴酚处理HL60细胞6、12、18小时后,DNA-laddering Kit提取DNA,琼脂糖电泳检测,三个时间点均未出现DNA梯带。 5.透射电镜观察和厚朴酚处理后的HL60细胞,未出现凋亡特征形态 15μg/ml和厚朴酚处理HL60细胞8小时后,收集细胞,样品处理包埋切片后,透射电镜观察可见,和厚朴酚处理后,HL60细胞核没有较大的变化,胞膜较为完整,也没有内容物溢出。但出现线粒体异常,胞浆内可见多层膜包裹的涡旋体结构受大量双层膜的泡状结构。


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