脂肪酶构象的刻录及荧光光谱分析

【摘要】：本文提出通过构建油包水(W/O)型微乳体系,使酶分子能够在有机相中被反应底物诱导出活性构象,利用高交联度聚合物对该构象进行刻录,比较了底物诱导对刻录酶活性的影响,考察了刻录酶在水相中催化特性,并对脂肪酶溶液和刻录酶聚合物在各种变性条件下的荧光光谱进行分析。 文中采用九种不同链长的单体和两种交联剂为聚合原料,紫外光引发聚合并干燥、研磨之后,获得18种不同载体的刻录酶聚合物。I(聚乙二醇400二丙烯酸酯)和G(聚乙二醇200二丙烯酸酯)两种作为功能单体时其活性和活力收率最高,Ib的活性高达3.6U/g,其活力收率为346.4%。研究发现四种活性最高的刻录酶聚合物(Ia,Ib,Ga,Gb),在强酸(pH=3.5)、强碱(pH=12.1),高温(80℃)下都保持其大部分活性,而脂肪酶液在相同条件下完全失活,证明这种刻录方法有效提高了脂肪酶的稳定性。 用月桂酸为底物诱导脂肪酶构象并进行刻录,接着用有机溶剂抽提洗脱底物月桂酸获得诱导刻录酶聚合物。选用丙酮和石油醚作为抽提溶剂,两者的洗脱效果相差不大,但是用石油醚洗脱后的聚合物内酶活性较高。对得到的诱导刻录酶进行活性测定和分析,发现其活性是未诱导刻录酶活性的两倍以上;并且诱导后的刻录酶聚合物具备与未诱导的刻录酶聚合物相近的稳定性。 本文还对游离脂肪酶溶液和刻录酶聚合物内蛋白质构象用荧光光谱进行了研究,游离脂肪酶溶液依据其内源的色氨酸残基进行光谱测定,对FITC(异硫氰基荧光素)荧光探针标记后的脂肪酶进行刻录并光谱测定。发现游离酶蛋白质在高温(80℃),强酸(pH=3.5)、强碱(pH=12.1),变性剂(盐酸胍和脲)的作用下基本表现为荧光强度增大,最大发射波长在331～350nm之内逐渐增大,说明蛋白质整体构象从球状到了伸展状态。刻录脂肪酶聚合物中荧光探针的荧光强度是表征了蛋白质表面氨基酸的距离变化,结果显示在强酸(pH=3.5)、强碱(pH=12.1)、变性剂(盐酸胍、脲和乙醇)及高温(80℃)条件下,荧光强度一定程度增大,即部分蛋白质的构象发生改变。