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三唑磷酶联免疫分析方法及试剂盒的研究

陈则利  
【摘要】:本研究在不同间隔臂长的两种半抗原O-乙基,O-[1-苯基-(H-1,2,4-三唑-3-丙基),N-(3-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(THBu)和O-乙基,O-[1-苯基-(H-1,2,4-三唑-3-丙基),N-(5-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(THHe)基础之上,分别与BSA偶联获得免疫原,结合比分别为16.6:1和8.2:1,经免疫兔子得到两种抗三唑磷多克隆抗体(抗THBu抗体、抗THHe抗体),相应冻干粉的效价分别为5.12×10~5和2.56×10~5。 通过比较不同的ELISA方法,选用了包被抗体直接竞争ELISA分析方法,包被抗THBu抗体与三唑磷或酶标半抗原HRP-THHe竞争反应。对固相载体、包被缓冲液、盐离子浓度、甲醇浓度、包被温度、时间、减少非特异性吸附的方法等因素的筛选试验比较,优化了酶联免疫分析的方法和条件。优化后结果显示:用美国CoStar板,pH7.4 0.01M PBS稀释包被抗体,在37℃下包被2h效果最佳;反应介质加入2%牛奶可减少非特异性吸附,提高检测灵敏度;盐离子浓度0.02M,甲醇含量5%有利于抗原抗体竞争反应。利用优化后的分析条件,用直接竞争ELISA方法进行了抗体亲和性和特异性研究。结果表明,抗THBu抗体对三唑磷有较高的亲和性,三唑磷与抗体在1.95-1000ng/mL浓度范围内,抑制率与浓度呈线性关系,线性回归方程为y=12.622Ln(x)-2.092,R~2=0.993,抑制中浓度IC_(50)=62.0ng/mL,最低检测限IC_(20)=5.76ng/mL。抗THBu抗体对三唑磷有很高的特异性,对各类似物如二嗪磷、毒死蜱等的交叉反应率2.4×10~(-4)。 用抗THBu抗体初步研制了三唑磷残留检测用直接竞争ELISA试剂盒,对样品基质影响、试剂盒保存期、试剂盒检测数据评价进行了初步试验,可用于水、稻米、黄豆(干)、胡萝卜、土豆、大白菜、洋葱、茄子、梨、柑桔等样品的检测。试剂盒准确度较好,除梨样品添加回收率在50%左右,其余样品在61.48~132.27%;试剂盒的重现性好,除胡萝卜样品外,其他板间变异系数均小于12.93%,可满足样品中三唑磷残留量的检测。本研究为开发具有自主知识产权的国产化试剂盒奠定了基础。


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