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中国腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)不同地理群体形态学及特异性检测研究

刘斌  
【摘要】:腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thrnoe,1945),也称马铃薯腐烂茎线虫,是一比较重要的植物病原线虫,世界上许多国家和地区都将该线虫列为检疫性的有害生物。本研究对腐烂茎线虫的不同地理群体从形态学和分子生物学两方面进行了比较和分析,同时研究了腐烂茎线虫单异活体培养方法,并建立了腐烂茎线虫特异性检测方法。 以腐烂茎线虫泰安群体为供试虫种,用玉米培养基培养的灰葡萄孢菌(Botritis cinerea)对腐烂茎线虫进行的单异活体培养,系统的比较了20℃和25℃两不同的温度对培养的影响,建立了在室内快速和大量繁殖腐烂茎线虫的方法,结果表明:25℃下腐烂茎线虫在灰葡萄孢上黑暗条件下培养的效果较佳。 通过对兰州、潍坊和泰安腐烂茎线虫三个地理群体的形态学观察及测量,结合扫描电镜对体表形态的描述发现:寄生于兰州当归上的腐烂茎线虫群体与寄生于潍坊甘薯上的茎线虫群体和泰安甘薯上的茎线虫群体之间略有差异,但其各项形态测量值均在正常范围内。 对全部七个地理群体的样品rDNA ITS区进行了PCR扩增,并用MvaⅠ、Hin6Ⅰ、AvaⅠ、HaeⅢ、AluⅠ、HinfⅠ、RsaⅠ、和Bsh1236Ⅰ等8种限制性内切酶对扩增产物进行了RFLPs分析,对兰州、泰安和潍坊群体的扩增产物进行了序列测定比较。结果表明:兰州群体扩增片段长度为915bp,潍坊群体为867bp,其余五个群体均为727bp;RFLPs结果表明:七群体体的rDNA ITS区扩增产物分别经MvaⅠ、AvaⅠ、AluⅠ和HinfⅠ四种限制性内切酶单酶切后,除兰州和潍坊群体外其他群体的酶切图谱均相同。8种限制性内切酶对兰州、泰安和潍坊三个群体体的酶切图谱均不相同,表明兰州、潍坊群体与其他五个群体相比发生了一定的种内变异。序列测定和分析比对结果表明:兰州群体和潍坊群体与其他群体相比,发生了序列的插入,除插入序列外,其他碱基序列的同源度在98%以上。 根据腐烂茎线虫rDNA ITS区的序列特征,设计出种特异性引物,对所有腐烂茎线虫种内群体及属间不同群体样品的rDNA ITS区相应区段的扩增,以验证其特异性,同时对分别由1-5条腐烂茎线虫粗提的DNA进行特异性扩增以验证其灵敏度。结果表明:所有的腐烂茎线虫群体均可以特异性扩增—346bp的片段,而所有的属外种均没有扩增片段;由1-5条腐烂茎线虫进行的特异性扩增也获得了所需的目的片段。显示该特异性引物具有较高的稳定性、特异性和灵敏度,能快速、准确的检测出腐烂茎线虫。


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