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大熊猫基因资源库构建及粪便高质量DNA提取方法的建立

余建秋  
【摘要】:1.本文以大熊猫的成纤维细胞和肝组织细胞为材料,以pBeloBAC11为载体,构建了大熊猫基因组的细菌人工染色体DNA文库。该文库包含了93700个克隆,分别保存于977块96孔细胞培养板中。经过对100个随机抽样的克隆分析表明,插入片段的平均大小为160kb,相当于大熊猫基因组的5倍,即5个库容量。酶切10个克隆证明,经过100代繁殖后,其插入片段仍稳定不变。 2.采用RNeasy Mini Kit提取大熊猫肝脏和脑组织的总RNA,经oligotex试剂盒纯化得到mRNA。利用SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技术,构建了肝脏和脑组织的全长cDNA文库。在构建完成的文库中,肝脏文库含有约5.0×10~6个重组子,而脑组织文库含有约3.5×10~6个重组子。在2个文库中,插入的cDNA长度为400bp—4kb,重组率高达90%以上。鉴定结果表明,大熊猫肝脏和脑组织cDNA文库质量良好,为进一步筛选和克隆大熊猫肝脏与脑组织特异性表达基因,提供了材料平台。 3.通过本研究,建立了从大熊猫粪便样品中提取高质量DNA的技术体系:(1)通过足量粪便提取足量的DNA:(2)加入BSA能有效控制PCR抑制物的干扰作用;(3)通过分级离心的方法富集大熊猫消化道上皮细胞。研究同时表明,使用该方法还能够从福尔马林固定的粪便中提取大片段的DNA。这一技术体系的建立,促进了大熊猫保护遗传学的研究,也为其它野生动物的保护遗传学研究提供了良好的技术借鉴。


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