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三个水稻叶色突变体的鉴定与基因克隆

刘文真  
【摘要】:突变体是功能基因组学研究的重要材料。以粳稻品种(Oryza sativa L.subsp.japonica)日本晴为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,我们实验室构建了由20000多个独立转基因株系组成的T-DNA插入突变体库。从该突变体库T_1代群体中寻找性状可见突变体,发现了三个叶绿素缺陷突变体:低温敏感的叶色突变体ltc、缺叶绿素b突变体cbl和高温敏感叶色突变体cde(t)。本论文针对这三个突变体,开展了性状鉴定、遗传分析、基因克隆和初步的功能验证的研究。主要结果如下: 1.ltc突变体是低温敏感的叶绿素缺陷突变体,在限制性温度(23℃或更低温度)下,突变体叶片出现大面积白化的现象,色素含量测定显示,突变体叶绿素和类胡萝卜素含量明显低于野生型植株,然而生长在高温条件(32℃)下,该突变体和野生型植株叶绿素含量差别不大;遗传分析表明该突变是单基因控制的隐性突变。 2.PCR和潮霉素抗性分析显示突变体ltc突变性状和T-DNA插入共分离;通过TAIL-PCR获得了插入位点的旁邻序列,序列分析显示T-DNA插入到一个H~+-ATPase基因的第一个外显子上。构建了ltc基因的干涉载体,遗传转化后获得了叶绿素缺陷表型的T_0代转基因植株,这些植株和相同温度下的ltc突变体表型相似。 3.cbl突变体是完全缺乏叶绿素b突变体,突变体具有叶黄,半矮化和分蘖少的特点;遗传分析显示该突变性状是由一对隐性核基因控制的;突变体和T-DNA的共分离分析表明叶色突变不是T-DNA插入引起的。 4.构建了cbl基因的定位群体,通过大量cbl位点附近分子标记的获得,构建了cbl位点的高密度物理图谱,最后将cbl基因定位于第10染色体分子标记IDJ9和RM496之间23kb的区段:序列分析显示叶绿素a氧化酶基因是cbl基因的候选基因,构建了叶绿素a氧化酶基因的干涉载体,遗传转化后获得了叶色黄绿的T_0代转基因植株。 5.cdel(t)突变体是高温敏感的叶绿素缺陷突变体,该突变体在非限制性温度下(23℃或更低的温度)表型正常,然而在限制性温度下(26℃或更高的温度)呈


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