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纳豆激酶和hGM-CSF在家蚕杆状病毒表达系统中表达纯化及活性研究

朱立成  
【摘要】:纳豆激酶(nattokinase,NK)是由纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)或纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto)分泌的一种具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶。体内外实验证明该酶能显著溶解体内外血栓,明显缩短纤维蛋白的溶解时间。并具有激活静脉内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-PA),降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂(pAI-1)和催化尿激酶原转变成尿激酶等功能。动物实验和人体志愿者实验表明,纳豆激酶经口服后可迅速入血,纤溶活性强,作用时间长,具有安全性好、口服有效等优点。 本研究第一部分内容是克隆了纳豆激酶基因。用PCR的方法从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中,克隆了包括编码信号肽、前导肽和成熟肽序列的纳豆激酶基因。基因测序结果表明,本研究克隆的纳豆激酶基因和Nakamura报道的Bacillus subtilis var.natto subtilisin NAT(aprN) gene(genbank 登录号:S51909)序列完全一致。 本研究第二部分内容是在大肠杆菌中表达了纳豆激酶基因并制备了抗纳豆激酶多克隆抗体。把纳豆激酶基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a~+的BamHI和XhoI位点上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了纳豆激酶基因。SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌中表达的纳豆激酶融合蛋白分子量约为31kD。表达产物通过HiTrap~(TM) Chelating HP亲和层析柱纯化。纯化产物与弗氏佐剂混合研磨制备了乳化疫苗,皮下多点免疫新西兰大白兔,制备了抗纳豆激酶抗体血清。抗体血清用Protein A亲和凝胶柱纯化。用琼脂板双向扩散实验初步检测了抗体滴度。ELISA间接法测得抗体滴度大约为1:16000,Western blotting检测含重组质粒的大肠杆菌总蛋白和纯化的纳豆激酶融合蛋白都有一条特异的条带。 本研究第三部分内容是在家蚕杆状病毒表达载体系统中表达了纳豆激酶基因。把纳豆激酶基因克隆到家蚕杆状病毒表达载体系统转移载体pBacPAK8的EcoRI和BamHI酶切位点之间,获得重组转移载体pBacPAKNK。将重组转移载体DNA和线性化的Bm-BacPAK6病毒DNA共转染BmN细胞,通过3轮空斑筛选获得纯化的重组病毒Bm-BacPAKNK。Bm-BacPAKNK感染BmN


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