嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

【摘要】： 脂肪酶(三脂酰甘油酰基水解酶，EC 3.1.1.3)广泛存在于动植物和微生物中，可催化三脂酰甘油的酯键水解，也可催化酯化、酯交换、醇解、酸解等反应，在洗涤剂工业、食品加工、皮革造纸等方面具有广泛应用。近年来，来自嗜温和嗜热微生物的热稳定脂肪酶的基本性质和工业应用倍受关注，其中主要来源之一是2001年新命名的嗜热脂肪地芽孢杆菌。但由于野生菌产脂肪酶能力低，主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌，通过表达来获得相应的脂肪酶。本课题亦采用此方法，在大肠杆菌中克隆并表达嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因。 本文首先在由胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、NaCl组成的培养基中65℃条件下培养野生型嗜热脂肪地芽孢杆菌，收集菌体后采用合适的方法提取野生菌基因组作为PCR扩增模板，Pfu酶作DNA聚合酶，扩增得到约1.3kb条带，与pMD18-T Simple Vector连接进行TA克隆测序，验证目的基因得到正确扩增。 表达载体pET28c(+)及TA阳性克隆用BamHⅠ、NdeⅠ双酶切后，经T4 DNA连接酶连接构建得到碱基数为6590bp的重组质粒pET28c(+)-lipase，在DH5α中得到高效扩增。 克隆成功后，将重组质粒转化E．coli BL21(DE3)中表达，经SDS电泳与脂肪酶活性测定验证脂肪酶得到有效表达。对重组菌表达条件进行优化，培养至OD_(600)在1.0左右，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，28℃诱导6小时，以橄榄油为底物，脂肪酶酶活达到1.88U/mg。 最后对重组菌E．coli BL21(DE3)/pET28c(+)-lipase所表达的脂肪酶的一些性质和影响酶活的因素进行了初步考察：在pH8.5的Tris-盐酸缓冲液(0.05mol/L)中，55℃条件下酶活最高，55℃时半衰期约8小时，10mM的Zn~(2+)、Fe~(2+)对酶的抑制显著，10mM的PMSF与粗酶液混合30分钟后酶活几乎完全被抑制。