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重组大肠杆菌高效生产具生物活性的人β-防御素和牛肠激酶的研究

黄磊  
【摘要】: 人β-防御素是近来年发现的具有广谱抗菌活性并在机体抵御外来微生物入侵中起防御作用的一类阳离子抗菌肽。肠激酶是哺乳动物肠道内的一种丝氨酸蛋白水解酶,能够特异性的识别(Asp)_4-Lys序列,起到把胰蛋白酶原转变成胰蛋白酶的作用。 本论文研究了使用基因工程技术生产人β-防御素3及4(HBD3、HBD4)和牛肠激酶轻链(BEKLC)的方法。建立了从获得HBD3、HBD4和牛肠激酶轻链基因、载体构建、表达优化、产物分离纯化、BEKLC包涵体复性,直到生物活性测定等的完整工艺。 经过密码子优化全基因合成了HBD3及4的基因,构建了大肠杆菌融合表达HBD3及4的基因工程菌,通过对摇瓶表达条件的研究,获得了如下的优化培养条件:在MBL培养基,培养温度为34℃,在对数生长中期添加终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导的情况下,HBD3和HBD4重组菌分别诱导8 h和6h终止发酵,首次实现了融合蛋白的高水平表达。HBD3融合蛋白的产量为2.55g/L,HBD4融合蛋白的产量达到2.68 g/L。 经过密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因(sBEKLC),采用质粒pET-39b(+)构建了融合表达载体,成功地在大肠杆菌中进行了表达,融合蛋白产量达到151.2 mg/L,i.e.80.6 mg/L sBEKLC。使用渗透冲击技术从细胞周质中提取sBEKLC,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8mg sBEKLC,在类似的研究工作中处于较高的水平。经检测,sBEKLC具有生物活性。 部分表达的sBEKLC融合蛋白为不可溶,应用镍离子金属螯地合层析对包涵体进行了纯化和复性研究,优化的复性条件为:50 mM Tris-HCl(pH 8.0),0.3 MNaCl,2 Murea,10 mM Imidazole,3 mM GSH,0.6 mM GSSG条件下,复性6 h结束,复性产物具有生物活性。 将自制的肠激酶轻链成功地用于人防御素融合蛋白的切割以释放出有生物活性的成熟的产物。对重组菌生产的人β-防御素-3及4的分离纯化工艺进行了研究,分别建立了成熟HBD3总收率为41%、纯度为92%和成熟HBD4总收率为44%、纯度为95%的分离提纯工艺;测定了成熟产物的生物活性,所得重组蛋白经测定具有抑菌活性。


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