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利用短乳杆菌制备γ-氨基丁酸相关过程研究

黄俊  
【摘要】: γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,简称为GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸,为哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质,具有降血压、治疗癫痫、镇静安神、增强记忆、控制哮喘、调节激素分泌、促进生殖、活化肝肾等多种生理功能,其制备和应用广受人们的关注与重视。 本文系统地研究了利用短乳杆菌生物法制备GABA的过程及相关工艺。论文在建立γ-氨基丁酸分析方法的基础上,从自然界选育得到了一株GABA高产菌株;通过对摇瓶培养条件和发酵罐培养条件的优化,提高了GABA的发酵产量;采用游离细胞和固定化细胞对催化合成GABA的反应条件进行了优化。此外,对短乳杆菌细胞内催化合成γ-氨基丁酸唯一的关键限速酶—谷氨酸脱羧酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了初步的研究。 首先,建立了GABA的定性和定量方法,纸层析和薄层层析法用于GABA定性分析,高效液相色谱法(HPLC)用于GABA定量分析。采用HPLC定量分析GABA时,以丹磺酰氯作柱前衍生剂,样品的pH高于7.5以及衍生化时间超过20min,衍生化反应稳定;GABA浓度(C)在0.1~2mM之间与峰面积(A)线性关系良好,线性方程为A=313.242·C+8.314,相关系数R为0.9997,GABA的加标回收率为95.30%~106.34%。 其次,从未灭菌的新鲜牛奶中筛选到一株产GABA的菌株,记为hjxi-01,发酵72h后GABA的产量6.9g/L。根据菌株hjxj-01的菌落形态以及生理生化特性,鉴定为短乳杆菌Lactobacillus brevis hjxj-01。以Lactobacillus brevis hjxj-01为出发菌株,经UV和~(60)Coγ-射线反复诱变处理,以含不同浓度的GABA梯度平板进行筛选,得到一株高产GABA的突变株Lactobacillus brevis hjxj-08119,发酵72hGABA的产量17g/L,比野生菌株产量提高了140%,此高产突变株遗传性状稳定,传代12次,菌株未出现回复突变情况。高产突变株Lactobacillus brevis hjxj-08119已在中国微生物菌种保藏管理委员会(CGMCC)保藏,保藏编号为CGMCCNO.1306。 第三,利用Plackett—Burman设计对影响Lactobacillus brevis hjxj-08119发酵生产GABA的15种相关因素进行了效应评价,筛选出具有显著正效应的三个因素:葡萄糖、MnSO_4·4H_2O和L-谷氨酸钠(L-MSG),其他因素对GABA产量无显著影响。然后对具有显著正效应的三个因素进行进一步考察,确定了三个因素的取值范围,以Hybrid设计得到的实验数据作为人工神经网络(ANN)训练样本,建立BP(back propagation)神经网络模型,粒子群(PSO)算法对建立的ANN模型进行全局寻优,得到最佳培养基组成为(g/L):葡萄糖17.6,酵母膏15,蛋白胨5,乙酸钠3,MgSO_4·7H_2O 0.03,MnSO_4·4H_2O 0.02,NaCl 0.001,FeSO_4·7H_2O 0.001,L-MSG73.3,初始pH6.8,发酵温度30℃,250mL三角瓶中的装液量为50mL/250mL。在此发酵条件下,GABA的发酵产量达到33.42g/L,较突变株Lactobacillus brevishjxi-08119的发酵产量17g/L提高了97%。 第四,在3.7升发酵罐中对GABA发酵的操作条件(溶氧和pH控制)以及补料进行研究。结果表明,好氧发酵有利于菌体生长,最大菌体干重可达2.78g/L,而厌氧发酵则有利于产物GABA的生成,发酵72h后GABA的浓度达到23.94g/L。在兼性厌氧条件下,不同pH控制方式下对GABA分批发酵的影响有较大差异,控制pH为5.0时GABA产量最高,达到40.73g/L(72h)。对控制pH5.0的GABA发酵过程进行分析,基于Logistic方程和改进的Luedeking-Piret方程,分两阶段建立控制pH5.0发酵生产GABA的动力学模型,该模型能较好地预测细胞生长、底物消耗以及GABA合成过程。对GABA的补料发酵进行了初步研究,经过四次补料,GABA的最终浓度达到76.36g/L,分别比摇瓶发酵、厌氧发酵以及控制pH5.0的发酵产量提高了128.6%、219%和87.5%。 第五,运用ANN模型结合PSO算法对游离短乳杆菌细胞催化合成GABA的反应条件进行了优化,得到的最优催化反应条件为:收集发酵60h的短乳杆菌细胞进行催化,缓冲体系为25mL柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液(100mM,pH4.23),反应液中包括120mM L-MSG,0.83g/L FeSO_4·7H_2O,10μM 5'-磷酸吡哆醛(PLP),2.68g DCW/L,在40℃恒温静置反应5h。在得到的最佳催化条件下,进行了四次实验验证,得到GABA的平均产量为9.34±0.22g/L,预测结果(9.4g/L)与实验情况吻合较好。对响应面(RSM)模型和ANN模型的预测性能进行了比较,结果表明,ANN模型的预测性能稍优于RSM模型。 第六,对利用海藻酸钙胶珠包埋短乳杆菌细胞催化合成γ-氨基丁酸的反应特性进行了研究。优化的胶珠中细胞密度为11.2g细胞干重(DCW)/L,反应最适的pH和温度分别为pH4.4和40℃;细胞经固定化后,温度稳定性显著提高。固定化连续进行10批次催化反应后(共80h),GABA的产率仍在50%以上,并且胶珠仍保持较好的完整性。 最后,对Lactobacillus brevis hjxj-08119细胞中的谷氨酸脱羧酶(GAD)进行了分离纯化,建立了有效分离纯化GAD的工艺流程,即“溶菌酶处理——→French press细胞破碎——→30%~90%硫酸铵分级盐析——→Q Sepharose FF离子交换层析——→Sephacryl S-200凝胶过滤层析——→Resource Q离子交换层析”。整个工艺活性收率为16.95%,纯化倍数为43.78,比活达到了3.94U/mg(蛋白),由SDS-PAGE得到的GAD分子量约为62kD。对纯化后GAD的酶学性质进行了初步研究,最适反应温度为37℃,最适反应pH为4.4,PLP对酶活力无显著激活作用,酶最大反应速度V_(max)为6.59U/mg,常数K_m为8.22mM。


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