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重组P450 BM3工程菌制备靛蓝过程优化、P450 BM3-GDH共表达体系建立及其在靛蓝制备中的应用研究

陆燕  
【摘要】: 靛蓝是一种重要的色素,它广泛应用于印染、医药和食品工业。近年来,利用生物法制备靛蓝已经引起了相关研究者的重视,这对解决化学合成靛蓝所带来的环境污染问题具有重大意义。本文利用能表达P450 BM3的重组大肠杆菌催化吲哚制备靛蓝,研究了游离细胞和固定化细胞催化的反应特性。构建了能共表达P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的重组菌,解决了P450 BM3催化反应的辅酶再生问题。以该重组菌作为还原型辅酶NADPH的再生系统,研究了其催化吲哚制备靛蓝的反应特性。 第一,针对P450 BM3在重组菌中的表达量很低,不能很好地满足反应的需要,采用Plackett-Burman设计和杂合设计相结合对重组E.coliBL21(pET28a(+)-P450 BM3)表达P450 BM3的发酵条件进行了优化。先用Plackett-Burman设计,从众多影响重组菌表达P450 BM3的因素中有效地筛选出了最为重要的因素,再用响应面法进行了优化,得到了较佳表达条件。通过优化,P450 BM3酶活从37.6×10~(-3) U/ml提高到了57.9×10~(-3) U/ml。优化结果与实际实验结果吻合较好。 第二,采用重组E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)细胞制备靛蓝,考察了实验中各反应条件对重组菌细胞进行催化反应的影响。结果表明,pH 7.0-7.5,温度35℃,底物浓度0.5 mmol/L为较好的反应条件。在此条件下,反应进行8 h后,靛蓝收率可以达到29.43%;加入5 g/L葡萄糖时,可以将靛蓝收率提高到44.08%;高浓度的底物和产物对合成反应具有一定的抑制作用。在此基础上,进一步考察了辅酶再生对重组E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)细胞催化吲哚制备靛蓝的反应的影响,结果表明,在反应体系中加入NADP~+和葡萄糖脱氢酶,能有效地促进NADPH再生,使反应得以持续进行。 第三,采用了海藻酸钙胶囊化重组E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)细胞催化吲哚制备靛蓝。考察了固定化条件对反应的影响,实验发现,海藻酸钠浓度为1.0%(w/v),CaCl_2浓度为2%(w/v),凝胶反应时间为6 min时,可以得到较高的靛蓝收率。考察了固定化细胞催化的反应特性,发现固定化重组菌细胞催化吲哚制备靛蓝的最适反应温度和最适pH分别为35℃和pH 7.5;当底物浓度为0.5mmol/L时靛蓝收率最高。但同样存在与E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)游离细胞相类似的问题,即在过高浓度底物存在时对细胞催化的抑制作用。固定化大大提高了重组菌的热稳定性,固定化细胞连续进行5批次催化反应后,靛蓝收率并没有明显变化。 第四,为了解决辅酶再生问题,构建了能共表达P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的重组E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310)。对该重组菌表达P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的条件进行了优化,P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的比酶活分别可达8173.13 U/mg protein和0.045 U/mg protein。 第五,在优化的基础上对重组E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310)催化辅酶再生的能力进行了考察,结果发现该重组菌在催化吲哚制备靛蓝的反应过程中,在不添加额外的辅酶和葡萄糖脱氢酶的情况下,细胞能够完成吲哚到靛蓝的高效催化。同时还研究了重组E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310)催化吲哚制备靛蓝的反应特性。结果表明,吲哚浓度为5 mmol/L,葡萄糖浓度为100mmol/L,重组菌于35℃、100 r/min的条件下具有最高的催化效率。通过分批加入底物的方式,能有效解除底物的抑制作用。五次加入吲哚共13 mmol/L,反应进行到24 h,收率仍可达80%以上,反应液中最终靛蓝浓度可达4.71 mmol/L(1235.2 mg/L)。 第六,分别对有辅酶参与的P450 BM3和葡萄糖脱氢酶催化双底物的酶促动力学进行了初步研究。采用有序反应机制,得到了P450 BM3和葡萄糖脱氢酶的酶促动力学方程。在两个酶的动力学方程基础上,建立了描述双酶催化体系辅酶变化的函数: d[NADPH]/dt=V_(GDH)-V_(p450 BM3) d[NADP~+]/dt=-V_(GDH)+V_(P450 BM3) 利用所得的方程对实验数据进行了拟合,该方程能较好地描述反应过程中辅酶浓度随时间的变化趋势。


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