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豆粕异黄酮酶法提取及生物转化的研究

陈庆庆  
【摘要】: 大豆异黄酮是一类具有重要生理功能的植物雌激素,从豆粕中提取大豆异黄酮具有重要的经济意义。本论文对豆粕异黄酮的酶法提取及结构修饰进行了研究,主要结果如下: 建立了能够同时快速检出糖苷型和苷元型异黄酮的高效液相色谱(HPLC)法:检测波长为254nm,柱温40℃,流速1.0mL·min~(-1),流动相为溶剂A(10%乙腈,含0.1%三氯乙酸)和溶剂B(90%乙腈,含0.1%三氯乙酸),流动相梯度设置为在30min内,溶剂A从100%下降到30%。该测定方法能够在较短时间内(<20min),准确地分离出糖苷型和苷元型异黄酮。进一步研究发现:对于糖苷型为主的异黄酮,用HPLC法测定的总异黄酮含量是紫外分光光度法测定含量的60%左右;对于苷元型为主的异黄酮,用HPLC法测定的总异黄酮含量是紫外分光光度法测定含量的75%左右。采用薄层层析法定性检测糖苷型和苷元型异黄酮时,选用氯仿:甲醇:水=5:1:0.5作为混合溶剂系统,展开效果较好。其中苷元型异黄酮的R_f值大于糖苷型异黄酮。在研究大豆异黄酮的酶法反应中,根据R_f值可以判断出大豆异黄酮组分是否已由糖苷型转变为苷元型,从而快速地判断出大豆异黄酮结构修饰的进程。 采用不同酶制剂对豆粕进行预处理,发现Bacillus sp ZU-4纤维素酶预处理后,豆粕异黄酮的提取得率比常规方法提高了40%;黑曲霉(Aspergillus niger ZU-7)纤维素酶预处理后,大豆异黄酮的提取得率虽然没有改变,但能把以糖苷型为主的异黄酮转变为苷元型为主的异黄酮;里氏木霉(Trichoderma reesei ZU-5)纤维素酶预处理能使大豆异黄酮的提取得率提高60%,并能把糖苷型异黄酮转变为具有更高生理活性的苷元型异黄酮;木聚糖酶(200IU/g豆粕)预处理能使大豆异黄酮的提取得率提高67%;纤维素酶和木聚糖酶协同作用有利于提高豆粕异黄酮的提取得率,当每克豆粕的纤维素酶用量为5FPIU、木聚糖酶为100IU时,处理36h,异黄酮提取得率可提高72%。 对黑曲霉菌株(Aspergillus niger ZU-7)固态发酵产β-葡萄糖苷酶的工艺条件进行了优化。采用海藻酸钙包埋黑曲霉孢子使β-葡萄糖苷酶得到有效的固定。固定化β-葡萄糖苷酶可专一性地切除糖苷型豆粕异黄酮的葡萄糖基,形成生理活性更高的苷元型异黄酮。在重复分批反应条件下,连续7批的苷元型异黄酮得率均可保持在90%以上。采用连续反应工艺,当稀释率为0.12 h~(-1)时,苷元型异黄酮得率可达95%。 确定了提取豆粕中苷元型异黄酮的适宜工艺参数为:乙醇浓度为80%,料液比为1:5,提取温度为50℃,提取时间为4h,大豆异黄酮的提取率为0.31%。采用逆流萃取工艺,在逆流萃取5次的条件下,可以使异黄酮的提取得率从单次的0.31%提高到0.37%。采用搅拌回流法优于浸提法。 极性大孔树脂SD200适合于糖苷型异黄酮的精制,其适宜作用条件为:上柱液浓度为0.5 mg/mL,上柱量为7个树脂床体积(BV),上柱液pH为4,上柱吸附流速为1.0 mg/mL:洗脱条件:用80%乙醇作为洗脱剂,解吸流速为2mL/min。精制后糖苷型异黄酮纯度可达53%。弱极性大孔树脂HZ801适合于苷元型异黄酮的精制,适宜作用条件为:上柱液浓度为0.5 mg/mL,上柱量为6BV,上柱液pH为3—4,上柱吸附流速为1.0 mg/mL;洗脱条件:用95%乙醇作为洗脱剂,解吸流速为2.5mL/min。精制后苷元型异黄酮纯度可达55%。 本论文在豆粕异黄酮的酶法提取、利用固定化β-葡萄糖苷酶对糖苷型异黄酮进行定向修饰、以及针对糖苷型和苷元型异黄酮的分离提取等方面的研究成果对于深入了解纤维素酶的作用机制,拓宽微生物酶制剂的应用领域,促进利用植物原料提取高价值制品的产业化进程等具有重要意义。


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