构建降钙素基因相关肽的穿梭载体

【摘要】： 背景：降钙素基因相关肽(CGRP)是1983年应用DNA基因重组技术和分子生物学技术发现的第一个舒血管活性多肽，由37个氨基酸组成，它是降钙素基因在神经组织经翻译后表达的产物。CGRP广泛分布于中枢和外周神经系统、心脑血管系统、消化道和内分泌等系统。CGRP具有很强的舒血管活性，对心、脑血管有强大的扩张作用。CGRP与许多临床疾病有密切关系，是目前研究的热点之一。近年来，随着分子生物学的迅速发展，基因导入技术得到不断改进并在基因治疗中显示了良好的应用前景。腺病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体，作为非整合病毒，具有感染宿主范围广，外源基因表达水平高，在受染细胞内不发生整合，没有致癌和致突变的危险等优点，在基因导入研究中倍受关注。方法：本实验以25g普通成年雄性小白鼠为取材对象，从小鼠脊髓背根神经元中获取总RNA，在引物两端导入限制性内切酶识别序列，通过RT—PCR扩增得到CGRP的全序列。通过双酶切和连接反应将CGRP基因导入PUC57载体上，通过转化，筛选，将鉴定为阳性的重组PUC57-CGRP质粒与pShuttle-CMV质粒进行双酶切和载体连接反应，最后得到重组pShuttle-CMV-CGRP腺病毒穿梭质粒。结果： 1．成功通过RT-PCR扩增得到CGRP目标序列，全长433bp。2．成功构建重组PUC57-CGRP质粒。3．成功构建pShuttle-CMV-CGRP腺病毒穿梭质粒结论：腺病毒载体理化性质稳定．容易制备、纯化，病毒滴度高，转导效率较高，无致突变的优点。本实验中采用的腺病毒载体AdEasy系统是近年来较新的载体系统，同源重组效率较高，方法简便、快速、实验周期短。本实验构建的重组pShuttle-CMV-CGRP腺病毒穿梭质粒，为进一步制备CGRP的腺病毒载体，研究其在动物体内的基因治疗作用提供了非常理想的载体。