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PCR-SBT法研究浙江汉族人群HLA基因多态性

戴卫健  
【摘要】: 研究背景 人类主要组织相容性复合物(MHC)又称为HLA,是迄今为止发现的最复杂的显性多态性遗传系统,它在组织器官移植配型、疾病的关联和人类遗传学等方面意义重大。HLA在不同地域和种族人群的分布存在高度多态性,早期国内使用血清学方法进行研究,获得了低分辨的数据。随着分子诊断技术的发展,近几年来国外开始报道人群高分辨的遗传数据,但是目前有关中国人群各基因座位高分辨数据甚少。本研究论文的目的主要在于建立HLA高分辨的测序分型方法,探讨浙江汉族人群HLA基因座位的遗传多态性。 实验方法 1、DNA提取:标本来自本中心的随机献血人群,DNA抽提采用Invitrogen DNA抽提试剂盒。 2、PCR扩增:引物参照HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DPA1、-DPB1基因序列,扩增反应体系总体积为25μl。 3、PCR产物纯化:每孔中加入外切酶Ⅰ1μl(2U),碱性磷酸酶2μl(10U),ABI公司的9700型PCR自动扩增仪上酶切,37℃30min,80℃15min。 4、测序反应:HLA-Ⅰ类基因采用基因组全长扩增,然后分别针对外显子2、3、4设计测序引物进行双向测序。HLA-Ⅱ类基因采用扩增和双向测定外显子2序列,其中DRB1采用单链特异性引物扩增的方法。以纯化PCR产物为模板按BigDye Sequencing kit(ABI公司)试剂盒操作进行测序反应,ABI公司的9700型PCR自动扩增仪扩增,扩增条件为95℃预变性5min,95℃30s,47℃45s,60℃4min,35个循环,冷却至4℃。 5、测序产物纯化和上胶操作:采用乙醇/醋酸钠(终浓度分别为66%和0.083mol/L)法纯化测序PCR产物。 6、结果分析和判断:Assign 3.5分析软件和MT Navigator软件进行数据分析,由Assign 3.5软件指定最终结果。 7、统计学分析:基因频率(gene frequency,GF)采用直接计数法计算,单倍型频率(haplotype frequency,HF)、Hardy-Weinberg平衡检验及x~2检验均采用ARLEQUIN 2.0软件分析 结果1、在浙江汉族人群中发现的HLA-A,-B,-Cw,-DRB1,-DPA1,-DPB1的等位基因数分别为22、42、24、25、8和19个。该人群中最常见的各个位点的等位基因为A~*110101(25.5%)、A~*020101(13.5%)、A~*240201(13.0%)、B~*400101(12.5%)、B~*460101(10.0%)、B~*5801(8.5%)、C~*070201(16.5%)、C~*010201(15.0%)、C~*030201(8.5%)、DRB1~*090102(17.5%)、DRB1~*120201(12.5%)、DRB1~*150101(8.5%)、DPA1~*020202(47.0%)、DPA1~*010301(38.5%)、DPA1~*020101(10.5%)、DPB1~*0501(39.5%)、DPB1~*020102(13.5%)、DPB1~*040101(13.0%)。 2、该人群中常见的单倍体型有A~*330301-B~*5801(7.5%),A~*110101-B~*400101(5.0%),A~*240201-B~*400101(2.5%),A~*110101-C~*080101(4.0%),A~*0207-C~*010201(3.5%),A~*110101-C~*070201(3.0%),B~*460101-C~*070201(3.0%),B~*460101-C~*010201(2.5),B~*130201-C~*060201(2.5%),DRB1~*0901012-DPB1~*0501(9.0%),DRB1~*120201-DPB1~*0501(6.5%),DRB1~*150101-DPB1~*0501(3.5%),DPA1~*020202-DPB~*0501(29.5%),DPA1~*010301-DPB~*040101(10.5%),DPA1~*010301-DPB1~*020102(9.5%),A~*110101-B~*400101-C~*070201(4%),A~*110101-B~*1301-C~*030401(2%),A~*110101-B~*1502-C~*080101(1.5%),DRB1~*090102-DPA1~*020202-DPB1~*0501(6%),DRB1~*120201-DPA1~*020202-DPB1~*0501(4.5%),DRB1~*150101一DPA1~*020202-DPB1~*0501(3.5%)。 3、数据经过检验符合Hardy-Weinberg平衡。 结论 1、本研究建立的PCR-SBT方法是可行的。 2、本研究获取了浙江汉族人群HLA-A,-B,-C,-DRB1,-DPA1,-DPB1基因高分辨遗传数据。 3、获取了HLA-A,-B,-C,-DRB1,-DPA1,-DPB1基因单倍体型的遗传数据,为疾病连锁分析和遗传制图等的应用提供了基础数据。


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