收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

蛋白酶体抑制剂bortezomib在治疗胰腺癌中的实验研究

唐志宇  
【摘要】: 一研究背景与目的: 胰腺癌(pancreatic cancer)是一种临床表现隐匿,进展迅速和预后极差的消化道恶性肿瘤。手术切除是唯一根治的手段,但是,多数患者就诊时已属晚期,只有10%—20%的患者有手术切除机会;手术切除的病人术后也多发生复发和转移,故此胰腺癌的预后极差,总体5年生存率低于5%,确诊后平均生存时间不超过6个月。化疗是胰腺癌重要的辅助治疗手段,对于改善生存质量,延长生存期有一定作用。目前,吉西他宾是胰腺癌化疗的一线药物,但总体有效率低于20%。 蛋白酶体是一庞大的、多价复合酶,对于真核细胞处理废弃和损伤的蛋白质极为重要,负责大部分细胞内非溶酶体性蛋白质的降解。通过蛋白质的泛素化和降解,蛋白酶体调控细胞许多重要的功能,如细胞周期,基因转录和凋亡,因此成为肿瘤治疗的靶点。bortezomib是一种特异性较强的蛋白酶体抑制剂,目前作为具有良好前景的抗癌药物在研究中。注射用bortezomib(Velcade)已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。目前,对bortezomib在胰腺癌中的治疗作用也有一些研究,然而均不深入,其具体作用机制仍不确切。因此,了解bortezomib的药效机制,有助于我们在未来更加合理有效地应用其治疗胰腺癌。 我们通过一系列实验探讨了bortezomib对胰腺癌细胞株生物学行为的作用,采用Affymetrix公司的HG U133A 2.0芯片检测两个胰腺癌细胞株在bortezomib应用前后基因表达谱的变化,从而分析bortezomib的作用机制及其增强吉西他宾药效的机理。 二材料和方法 1.采用台盼蓝排斥试验法检测不同浓度梯度bortezomib(1nM、10nM、100nM、1μM、10μM)对细胞活力的影响,初步确定下一步实验浓度。MTT方法检测bortezomib(20、40、80、160nM)、吉西他宾单独应用及40nmol/L bortezomib与不同浓度吉西他宾联合应用时对细胞生长的抑制。选择合适的浓度及作用时间点进行后续实验。 2.对数期生长的BxPC-3细胞每只0.1ml(5×10~6)接种于4-6周龄雌性BALB/Cnu/nu裸小鼠背部皮下,制成胰腺癌种植瘤模型,待肿瘤全部长出后随机分为4组,分别给予生理盐水,bortezomib(1.0mg/kg),吉西他宾(125mg/kg),及bortezomib(1.0mg/kg)联合吉西他宾(125mg/kg)每周一次腹腔注射,连续4周,研究bortezomib在体内的抗胰腺癌作用。 3.分别采用缺口末端标记法(TUNEL)、流式细胞术和透射电镜检测bortezomib在体外诱导的胰腺癌细胞凋亡。 4.采用Affymetrix公司的HG U133A 2.0寡核苷酸基因芯片,检测两种细胞株接受bortezomib处理前后的基因表达谱的变化,DAVID分析基因功能,进而探讨bortezomib的作用机制。 5.荧光定量RT-PCR方法(相对定量)对选择的芯片结果中差异表达的5个感兴趣的基因进一步验证。 6.统计分析。数据表达为均值±标准误,进行双侧t检验或单因素方差分析(LSD多重比较),P<0.05视为具有统计学意义。统计由SPSS 11.5统计包完成。 三结果 1.Bortezomib在体外对胰腺癌细胞生长的抑制 MTT方法检测不同浓度的bortezomib作用于胰腺癌细胞24h,48h,72h和96h的效应。80nM bortezomib在两细胞作用24h均引起中等程度的抑制(BxPC-3和PANC-1的抑制率分别为35.5%和33%),48h起则明显抑制(BxPC-3和PANC-1的抑制率分别为48.5%和54%),而160nM 48h起几乎全部抑制BxPC-3,72h起几乎全部抑制PANC-1。吉西他宾则对两细胞显示不同的敏感性,0.05μg/ml吉西他宾作用48h和72h后,引起48.33%和76%BxPC-3细胞死亡,而50μg/ml的吉西他宾才能引起相似的结果(45.67%和67%)。 Bortezomib在体外显示可增强吉西他宾的效果。0.05-50μg/ml吉西他宾单独或联合40nmol/L bortezomib作用于PANC-1,48h后显示50μg/ml的吉西他宾联合bortezomib处理时抑制率显著高于单独作用(P<0.05)。而应用低浓度吉西他宾(0.05μg/ml-5μg/ml)时,无统计学差异。BxPC-3细胞具相似的结果,0.05μg/ml-5μg/ml吉西他宾联合bortezomib处理48h,与单独作用相比显示显著增高的抑制率(P<0.05)。而应用低浓度的吉西他宾(0.005μg/ml)时,无统计学差异。 2.Bortezomib在体内对胰腺癌种植瘤生长的抑制 Bortezomib组和吉西他宾组与对照组相比,均显著减少肿瘤体积,两组间无统计学差异,联合治疗组的肿瘤体积显著小于Bortezomib组和吉西他宾组(P<0.05),而所有裸鼠无死亡,各组间的体重在治疗期间无显著差异,显示良好的耐受性。 3.Bortezomib在体外诱导胰腺癌细胞凋亡 流式细胞术:BxPC-3和PANC-1细胞接受Bortezomib、吉西他宾和联合处理24到48h,细胞周期分析显示经过24和48h后,联合治疗均引起sub-G_0期细胞数目的显著增多,提示bortezomib显著增加吉西他宾的诱导凋亡。 电镜观察:对照组BxPC-3细胞生长旺盛,细胞质中细胞器丰富,代谢活跃,染色质絮状弥散分布,细胞核分裂相多。Bortezomib组细胞24h出现早期凋亡,可见核浓缩,核边际化等各种细胞凋亡的表现,48小时此现象更加明显。类似的结果同样见于PANC-1细胞。 缺口末端标记法(TUNEL):BxPC-3细胞接受bortezomib(100nM)、吉西他宾(0.05μg/ml)和联合处理24h。观察计算凋亡率,bortezomib组(5.962±0.426%)和吉西他宾组(7.298±0.550%)显著高于对照组(0.490±0.010%)(P<0.001),联合组(29.426±1.223%)显著高于各单独作用组(P<0.001),单独作用组间无统计学差异(P=0.198)。 4.Bortezomib诱导之胰腺癌细胞表达谱变化 采用HG U133A 2.0寡核苷酸基因芯片检测两细胞株接受PBS(对照)及bortezomib(100nM)处理24h。在处理组和对照组比较中发现,Bortezomib诱导两种细胞3倍以上表达的共同基因44个(属于多种具有促进和抑制凋亡的不同功能的基因),抑制5倍以上的共同基因24个。GO分析44个基因,多数与未折叠蛋白反应(9 genes),细胞蛋白代谢(20 genes)和凋亡(8 genes)有关。Bcl-2基因被bortezomib不同程度地抑制(PANC-1,2倍;BxPC-3,3.73倍),其它Bcl-2家族基因如Bax,Bak1,Bad,Bik和Bcl211(Bcl-xl)等未见明显变化。对于NF-kB家族,两株细胞中其所有5个成员NFKB1(p105),NFKB2(p100/p49),RelA(p65),RelB和Rel均未被bortezomib引起变化。其它与凋亡或药物代谢有关的基因如TP53,ABCB1(mdr1)均无一致性的变化。 5.qRT-PCR验证基因芯片结果 验证了5个和凋亡有关的基因(GADD45B,DDIT3,PPP1R15A,HSPA1B,HSPB1),两种方法所得基因表达倍数大致相当。 四结论 1 Bortezomib在体内外有不同程度的抗胰腺癌作用,并能增强吉西他宾的效果。 2 Bortezomib在体外对胰腺癌细胞有显著的诱导凋亡,并能增强吉西他宾的效果。 3 Bortezomib能诱导胰腺癌细胞多种具有不同的促进和抑制凋亡的基因表达上调,这些基因协调作用,决定细胞的凋亡与否。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王晓东;;最简单的防癌处方[J];药物与人;2011年08期
2 李惠仙;麦垚;付雪梅;杨天睿;黄红;全晶;;CA19-9检测在老年胰腺癌患者中的临床意义[J];中国实用医药;2011年18期
3 俞有芳;;CA19-9、CEA、IGF-Ⅱ联检对胰腺癌的诊断价值[J];放射免疫学杂志;2011年03期
4 崔巍;徐笑红;;血清CA19-9、CA242、CEA、LAP联检诊断胰腺癌的临床价值[J];放射免疫学杂志;2011年03期
5 王勇;翟云起;陈飞;;胰腺癌基因肿瘤标记物研究新进展[J];中国伤残医学;2011年08期
6 C.Koelblinger;A.Ba-Ssalamah;P.Goetzinger;S.Puchner;M.Weber;K.Sahora;丁晓辉;;前瞻性评估比较钆喷葡胺增强3.0T MRI和64层螺旋CT对疑有胰腺癌病人的价值[J];国际医学放射学杂志;2011年04期
7 徐怡;涂兵;;胰腺癌的早期诊断进展[J];医学信息(上旬刊);2011年05期
8 吴爱祝;梁茱;王海枫;;胰腺癌患者血清中CA199、CA242、CA125、CEA检测分析[J];中国实验诊断学;2011年07期
9 刘志云;陈志刚;;中西医结合治疗胰腺癌疗效观察[J];实用医技杂志;2011年09期
10 任丽楠;郭晓钟;邹德莉;;胰腺癌误诊48例分析[J];人民军医;2011年08期
11 何利群;;胰腺癌的超声诊断[J];现代医药卫生;2011年13期
12 杨昨非;张军辉;;苦参碱对胰腺癌PC-3细胞凋亡及Bcl-2和bax表达的影响[J];中国医学工程;2011年06期
13 耿莎莎;江华;;胰腺癌与糖尿病相关性研究进展[J];国际消化病杂志;2011年03期
14 梁雪;聂桓;李钰;;胰腺癌早期诊断肿瘤标志物的研究进展[J];实用肿瘤杂志;2011年04期
15 杨鹏飞;;胰腺癌药物治疗进展分析[J];北方药学;2011年08期
16 徐永寿;;慢性胰腺炎并发胰腺癌的病例分析[J];现代预防医学;2011年15期
17 张洪亮;王先敏;肖春霞;;73例胰腺癌的临床分析[J];新疆中医药;2011年04期
18 谢勇;;雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226的体外抑制作用研究[J];海峡药学;2011年06期
19 陈姣红;胡红超;;三维适形放疗联合HIFU刀治疗胰腺癌的临床观察[J];中外医疗;2011年21期
20 范琳峰;雷长江;刘忠考;缪辉来;邱志东;陈明;陈念平;;胰腺癌细胞株Runx3基因启动子区CpG岛甲基化的检测[J];广东医学院学报;2011年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 谷雨妹;马怡晖;赵武干;张强;卢朝辉;陈杰;;靶向泛素化降解K-Ras癌蛋白对胰腺癌细胞体内、外生长的影响[A];中华医学会病理学分会2010年学术年会日程及论文汇编[C];2010年
2 郭晓钟;陈江;刘峰;任丽楠;王迪;赵佳钧;邵晓冬;李宏宇;刘旭;;人胰腺癌MUC1 mRNA转染树突细胞诱导特异性抗肿瘤免疫反应的体外实验研究[A];第九次全国消化系统疾病学术会议专题报告论文集[C];2009年
3 蔡建庭;马望前;陆新良;杜勤;钱可大;;内镜下逆行胰胆管造影术对胰腺癌诊断价值的研究[A];2005年浙江省消化系疾病学术会议论文汇编[C];2005年
4 汤永辉;高乃荣;石欣;;胰腺癌相关基因研究进展[A];中华医学会第十一届全国胰腺外科学术研讨会论文汇编[C];2006年
5 余中逊;;62例老年人胰腺癌临床分析[A];中国中西医结合学会第十三次全国消化系统疾病学术研讨会论文汇编[C];2001年
6 王绵;赵战胜;周红;张力辉;;胰腺癌伴发糖尿病15例分析[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年
7 高庆军;窦剑;王志通;曹经琳;邸恩昌;;术中应用射频消融治疗胰腺癌[A];第一届中国肿瘤靶向治疗技术大会论文集[C];2003年
8 吴艳辉;骆科美;刘靓;;超声检查在胰腺癌临床诊断的应用分析[A];第二十四届航天医学年会暨第七届航天护理年会论文汇编[C];2008年
9 周志刚;王振豫;王军委;;放射与5-Fu粒子联合植入治疗胰腺癌[A];中国(第七届)肿瘤微创治疗学术大会暨世界影像导引下肿瘤微创治疗学会成立筹备大会论文汇编[C];2011年
10 马霄虹;赵心明;欧阳汉;张红梅;周纯武;;3.0T MR动态增强扫描在正常胰腺及胰腺癌定量分析的初步研究[A];中华医学会第16次全国放射学学术大会论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 唐志宇;蛋白酶体抑制剂bortezomib在治疗胰腺癌中的实验研究[D];浙江大学;2007年
2 方薛泉;Hedgehog信号通路对胰腺癌细胞株氟尿嘧啶化疗敏感性的影响研究[D];中国协和医科大学;2010年
3 段小辉;MICA在NK细胞杀伤胰腺癌中的作用以及吉西他滨对胰腺癌细胞MICA蛋白脱落的影响[D];中南大学;2010年
4 刘哲;胰腺癌患者肿瘤组织及外周血浆中癌基因和抑癌基因的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年
5 张建军;TLR4受体及其信号通路在胰腺癌进展中的作用[D];华中科技大学;2010年
6 李军建;miR-181a—CARF靶向关系在胰腺癌中的研究[D];浙江大学;2011年
7 李志伟;胰腺癌外科治疗的临床研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2002年
8 吕顺莉;PCDH8和LRRC55基因异常甲基化在胰腺癌发病中的作用研究[D];第二军医大学;2010年
9 朱世凯;缺氧微环境中HIF-1α诱导MT2-MMP表达及对胰腺癌侵袭和转移作用的机制研究[D];华中科技大学;2010年
10 蔡清萍;三联脆组基因在胰腺癌发生发展中的变化及对其增殖的影响和作用机制的初步探讨[D];第二军医大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨新焕;慢性胰腺炎和胰腺癌的磁共振PWI应用研究[D];昆明医学院;2010年
2 蒋志斌;DNA甲基转移酶1、3b与p16蛋白在胰腺癌中的表达及其临床意义[D];南昌大学;2010年
3 王卫卫;miR-223在胰腺癌发病中的作用研究[D];第二军医大学;2011年
4 董家刚;Trophinin基因在胰腺癌组织中的表达及其临床意义[D];重庆医科大学;2011年
5 宋芳;冬凌草甲素对人胰腺癌SW1990细胞的生长抑制作用及其机制研究[D];苏州大学;2010年
6 王莹;基于重复结构卡的胰腺癌放疗MCNP模拟[D];东北师范大学;2010年
7 余志良;胰腺癌临床特征的流行病学研究[D];第二军医大学;2002年
8 胡晓宇;不可手术胰腺癌~(125)Ⅰ植入治疗的系统评价[D];新疆医科大学;2010年
9 陶冶;多层螺旋CT血管造影对胰腺癌可切除性评估的临床研究[D];吉林大学;2010年
10 杨晓鹤;不同b值磁共振扩散加权成像在胰腺肿瘤的应用研究[D];昆明医学院;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 通讯员 段文利 记者 范又;我国胰腺癌死亡率上升[N];光明日报;2003年
2 杨昆;胰腺癌为何青睐老总[N];健康报;2003年
3 记者 张小军;研究显示 胰腺癌疫苗有效[N];新华每日电讯;2001年
4 方留民;肥胖易导致胰腺癌[N];中国医药报;2001年
5 文信;易引发胰腺癌[N];医药经济报;2003年
6 记者 任海军;美发现重要蛋白质与胰腺癌生长有关[N];新华每日电讯;2009年
7 温欣;胰腺癌早发现早预防[N];医药养生保健报;2009年
8 复旦大学胰腺病研究所 倪泉兴;胰腺癌是“癌中之王”[N];健康时报;2010年
9 特约记者 杨凤;胰腺癌手术“量高质才会好”[N];健康报;2010年
10 空军总医院放射治疗科主任、主任医师、教授 夏廷毅;八成胰腺癌先掉体重[N];健康时报;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978