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趋化分子LTD4、S1P和SDF-1对造血干细胞作用及其机制的研究

薛兴奎  
【摘要】: 造血干细胞动员和归巢是多因素调控的过程,趋化分子和骨髓微环境在其中起着重要的调控作用。以前的研究结果表明,CD34~+造血干细胞和祖细胞表达三种趋化相关分子受体:CysLT1,S1P1和CXCR4。这三种受体都属于具有七次跨膜结构的G蛋白耦联受体家族(G protein coupled receptors,GPCR)。GPCRs是一大类受体蛋白超家族,参与广泛的细胞信号传导途径。而造血干细胞表面表达多种GPCR受体,调控细胞生长、增殖分化等功能。CXCR4是细胞表面常见的一种趋化因子受体,基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)是目前唯一己知的CXCR4配体,由骨髓基质细胞分泌。LTD4属于白三烯家族,是炎性细胞趋化因子中作用最强的半胱氨酰白三烯分子,主要由活化的单核细胞,肥大细胞和巨噬细胞等产生,参与多种重要的病理生理过程。LTD4主要通过受体CysLT1发挥效应,CysLT1受体结构与CXCR4等多种趋化因子受体相似。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)是磷脂代谢过程中的一种中间产物,S1P既可以作为胞内第二信使,又可以作为细胞间信号分子通过与细胞表面受体作用而发挥其广泛的生物学效应。目前已经克隆多种S1P受体,分别命名为S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5,CD34~+造血干细胞主要表达S1P1受体。由于这三种GPCR的配体都在骨髓微环境中存在,因此有可能调控造血干细胞的增殖等细胞功能。骨髓微环境中的基质细胞能够分泌CXCR4的配体SDF-1和CysLT1的配体LTD4,而S1P1的配体S1P可以由巨核细胞和血小板分泌。关于SDF-1对造血干细胞的趋化迁移、细胞生存等作用已有一些研究,但LTD4和S1P对造血干细胞增殖、迁移的影响及其分子机制,目前还不清楚。本课题主要以人造血干细胞和祖细胞为研究对象,研究LTD4和S1P对造血干细胞的增殖、粘附等效应的影响,并进一步探讨LTD4,S1P和SDF-1作用造血干细胞的信号传导机制。 我们应用添加造血因子的液体培养体系检测LTD4对造血干细胞的增殖能力的影响。在造血因子IL-3和SCF支持下,LTD4增加了新鲜分离的人CD34~+的造血干细胞的扩增。在液体培养基中培养1周后,加入不同浓度的LTD4的培养体系中的CD34~+细胞数量明显高于对照组。100nMLTD4作用最强,在这个浓度时,能使细胞数量与对照组相比增长69.47±3.01%。LTD4和不同的细胞因子组合结果发现LTD4在与IL-3联合应用时对造血干细胞的增殖能力最强。 为进一步确定LTD4在骨髓微环境的功能,我们应用高效液相色谱(HPLC)和较为敏感的酶标免疫分析方法检测骨髓内皮细胞和骨髓基质细胞合成和分泌LTD4的能力。在每1×10~6骨髓内皮细胞培养体系中,我们检测到LTD4浓度为6.05±1.95nM。而在同等数量的骨髓基质细胞培养体系中,我们检测到5.11±1.12nMLTD4。由于LTD4可以快速转变为LTC4,并可以接着代谢为LTE4,这三种白三烯总和浓度在骨髓内皮细胞培养上清可达21.35±5.25nM,在骨髓基质细胞中可达18.27±4.13nM。如前面的结果所示,LTD4在浓度较低的1nM时就可以引起人造血干细胞的明显增殖,提示骨髓基质细胞和内皮细胞分泌的LTD4足已在体内发挥相应的生理作用。而在去除造血干细胞单独培养的骨髓基质细胞和骨髓内皮细胞上清中,半胱氨酰白三烯浓度明显减少。这表明造血干细胞可以影响骨髓微环境中的骨髓基质细胞和骨髓内皮细胞的白三烯合成分泌或代谢。 为研究S1P对造血干细胞粘附能力的影响,我们检测了新鲜分离的人CD34~+造血干细胞的粘附能力。从人脐血分离的HUVEC接种于96孔组织培养板,在实验开始前用IL-1β刺激4小时。从正常供者外周血和骨髓分离的CD34~+细胞经LTD4和未经LTD4刺激后分别接种于96孔板,孵育相应时间后用流式细胞术检测粘附细胞。结果显示,经S1P刺激后的CD34~+细胞粘附比例明显上升,在1μMS1P处理组中,S1P作用1和5分钟时,粘附细胞数量达到最高,但并没有随着作用时间延长而增加。 S1P广泛存在于体内血液和骨髓中,因而我们试图观察S1P是否对人造血干细胞和祖细胞的增殖造成影响。分别使用造血刺激因子支持的液体培养体系和半固体培养基支持的集落形成试验,检测了S1P对人CD34~+细胞的增殖能力的作用。S1P对人造血干细胞和祖细胞的增殖没有明显的影响。在100nM到1μM的浓度,S1P作用组与对照组相比CD34~+细胞扩增数量没有明显的差异。 S1P作为体内血浆中存在的脂质介质,可能会延长造血干细胞的生存能力,我们采用Annexin V凋亡试剂盒利用流式细胞术观察了S1P对CD34细胞的生存能力的作用。结果显示,在1μMS1P作用下,CD34~+的造血干细胞和祖细胞的生存能力没有显著提高,不能减少CD34~+细胞的凋亡率。 我们利用Western Blot检测了LTD4诱导的人CD34~+细胞信号传导分子的活化情况。MAPK是常见的增殖相关分子,LTD4对MAP Kinase信号分子磷酸化的研究结果显示,在新鲜分离的人CD34~+细胞和CD34~+的人白血病细胞系KG1a中,LTD4都显著增加了MAPK(ERK1/2)的磷酸化水平。在KG1a细胞中,LTD4能在一分钟内快速增强ERK1/2的磷酸化,在5分钟左右恢复到接近正常水平。LTD4同样可以活化人CD34~+原代细胞MAP kinase。PI3K-Akt信号途径是影响细胞存活的重要途径之一,因此我们也检测了LTD4对Akt信号的影响,结果显示LTD4没有诱导Akt信号活化。 为了进一步了解和比较这三种趋化因子及其受体的信号传导机制,我们应用PTX观察信号传导途径中细胞表面受体偶联的G蛋白的作用。PTX是常用的研究信号传导工具,对特定的G蛋白亚单位有阻断作用。在刺激细胞之前,加入100ng/ml的PTX预孵育过夜。结果显示,在PTX预孵育细胞组,SDF-1诱导的MAP kinase磷酸化几乎完全被阻断。而在CD34~+细胞中,加入PTX作用组,LTD4引起的MAP Kinase磷酸化只能部分地被抑制。这提示LTD4通过CysLT1通过活化至少两种不同PTX-敏感Gi蛋白和非PTX敏感的G蛋白(主要是Gq蛋白)途径活化MAPK信号。 钙离子是细胞内重要的第二信使分子,我们采用Fluo-3/AM试剂利用流式细胞仪检测了细胞内钙离子的释放。结果显示,在从外周血或骨髓分离的CD34~+细胞中,LTD4引起的钙离子信号明显强于SDF-1诱导的钙离子动员。经过PTX作用后,SDF-1诱导的钙离子信号几乎完全被阻断,接近于起始水平。而PTX只能部分地降低LTD4引起的细胞内钙离子动员。 Pyk2分子是参与调节细胞运动的重要信号分子之一,同时也与多种信号途径相关联。我们应用Western blot技术检测了Pyk2信号分子的磷酸化水平。结果表明,LTD4与SDF-1都能够活化Pyk2分子,诱导Pyk2分子磷酸化。由于S1P也参与调控人造血干细胞的运动,因此同时检测了S1P对Pyk2信号的影响,发现S1P同样可以活化Pyk2信号分子。进一步应用PTX,观察不同G蛋白对Pyk2信号途径的作用。结果显示,PTX能够部分的阻断LTD4引起的Pyk2信号活化,但可以完全阻断S1P和SDF-1引起的Pyk2信号激活。 肌动蛋白聚合(Actin polymerization)是细胞移动的关键步骤,因而被常用来做为检测细胞运动的指标之一。在细胞经LTD4(1μM)和SDF-1(100ng/ml)处理后,我们采用流式细胞仪观察细胞肌动蛋白改变。结果显示,SDF-1能快速引起的人CD34~+细胞肌动蛋白聚合,在10秒钟达到最高点,随后迅速下降,在2分钟左右恢复到起始水平。在PTX预先作用组,细胞内的肌动蛋白聚合与对照组相比无显著变化,说明SDF-1诱导的肌动蛋白聚合几乎可以被PTX完全阻断,主要是Gai蛋白参与SDF-1诱导的细胞迁移。LTD4能够快速诱导人CD34~+细胞肌动蛋白聚合,在1μMLTD4作用细胞5秒后,细胞内F-actin增加约55%,随后在2分钟左右解聚到起始水平。与SDF-1不同的是,LTD4诱导的细胞肌动蛋白聚合只能部分的被PTX抑制,说明PTX敏感Gi和非敏感G蛋白都有参与LTD4诱导的细胞运动。 结论: 1.在CD34~+造血干细胞中表达CysLT1受体分子,骨髓基质细胞能够合成和分泌LTD4,LTD4能够通过CysLT1受体刺激人CD34~+造血干细胞增殖。 2.S1P作为一种脂质介质,能够增加CD34~+造血干细胞粘附,但不影响人CD34~+细胞的增殖能力和生存能力。 3.LTD4能够通过不同的G蛋白(Gi和Gq等)介导活化造血干细胞的MAPK信号分子、钙离子信号和Pyk2信号分子,诱导细胞增殖等效应。 4.PTX敏感G蛋白(Gi蛋白)和非PTX敏感蛋白(主要为Gq蛋白)都参与LTD4通过受体CysLT1诱导的CD34~+造血干细胞效应,而SDF-1/CXCR4只活化Gi蛋白介导的信号途径。 5.在人CD34~+造血干细胞中,CysLT1介导的钙离子内流和细胞增殖都明显强于 CXCR4介导的细胞效应,这可能与Gi蛋白和Gq蛋白都参与CysLT1介导的信号传导,而CXCR4和S1P1只活化Gi蛋白介导的信号传导通路有关。


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