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输卵管妊娠母胎界面着床相关因子表达的研究

季银芬  
【摘要】: 在过去的几十年里,盆腔炎发生率的增加同时伴随着异位妊娠发生率急剧增加,目前占所有妊娠的2%~3%,其中95%为输卵管妊娠(tubal pregnancy,TP),提示两者存在因果关系。但也不排除部分由于高水平诊断技术如高灵敏度hCG检测及高分辨率阴道超声的应用检测出原先未诊断出的异位妊娠的因素。炎症病理损害引起输卵管不通畅,导致胚泡滞留。确实,胚泡的滞留使TP成为可能,但必须完成关键的一步即胚泡的着床。由于透明带的限制,胚泡的大小同单个卵细胞相似,而输卵管峡部管腔最狭窄处直径约2mm。因而,TP发生可能与炎症情况下输卵管局部微环境的改变更为密切,分泌了一些相关的细胞因子、粘附分子等使胚泡完成着床。 正常情况下,着床是指胚泡进入子宫腔后与子宫内膜粘附并逐渐埋于其中的过程,包括胚泡的孵化、定位、粘附、侵入及随后的血管的形成等过程。子宫内膜随之发生一系列复杂而精细的生理变化。比例适当的雌、孕激素通过各自的受体作用于子宫内膜,是着床的总调控师,使子宫内膜间质水肿、血管扩张充血,为胚胎着床提供物质基础;间接或直接调控着细胞因子、生长因子及粘附分子的分泌和释放。从定位、粘附阶段看,目前较为肯定的影响因子有:①细胞因子和生长因子方面:白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、肝素结合性表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor,HB-EGF)、白介素-1β、集落刺激因子-1(colony stimulating factor-1,CSF-1);②粘附分子如整合素,人输卵管特异糖蛋白,trophinin、tastin、bystin斑。侵入期阶段,滋养叶细胞是浸润过程中的主要动因,而子宫内膜则表现为适时的调控以防过度的浸润,主要体现在内膜基质方面的功能。目前认为基质金属蛋白酶组织抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-3)是由基质细胞产生的周期依赖性的,是限制滋养叶浸润的主要抑制因子,在胚泡的着床部位含量最高。在胎盘血管网形成上,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)参与了正常宫腔内妊娠的植入和血管网络构建。 输卵管妊娠是正常的胚泡在异常位置的种植;胚胎滋养细胞的染色体分析与正常宫腔内妊娠相似,未发现异常。目前对输卵管妊娠的研究大多着眼于如何治疗的临床总结及病因因素的相关分析,对于其发生机理的基础研究甚少,国内几乎无。因而只能从正常宫腔内妊娠为切入点来研究输卵管妊娠。 为明确正常宫腔内妊娠着床相关的因子如雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、白血病抑制因子、整合素、VEGF是否参与了输卵管妊娠的植入,本文利用了免疫组化、蛋白免疫印迹技术从两个方面进行研究:1.上述因子在输卵管中的表达及定位,是否参与了输卵管妊娠着床的发生;2.慢性输卵管炎症是否会由于上述因子发生相应的改变而诱发其易于发生输卵管妊娠。 第一部分输卵管妊娠种植部位、非种植部位和慢性输卵管炎中雌孕激素受体的表达 方法:采用免疫组化方法对30例输卵管妊娠患者的种植部位和非种植部位(患侧输卵管),12例分泌中期慢性炎症输卵管壶腹部ER、PR的定位及半定量研究,并以17例分泌中期正常壶腹部输卵管为对照。 结果:1.免疫组化研究显示:ER、PR定位在大部分上皮细胞和间质细胞的细胞核中,也表达于平滑肌细胞的细胞核中。同一个患者种植部位ER、PR染色强度低于非种植部位,存在显著差异(分别为t=—3.895,p=0.001;t=—3.574,p=0.001)。2.半定量分析发现种植部位ER、PR表达低于慢性炎症组(均为p<0.01)和正常组(分别为p<0.01;p<0.05)。但在非种植部位和慢性炎症组、正常组之间,慢性炎症组和正常组间ER、PR表达无统计学差异(均为p>0.05)。3.计算每份标本的ER/PR进行非参数检验。炎症组ER/PR值大于任何一组。炎症组与种植部位、非种植部位、正常组间(分别为p<0.05;p<0.01;p<0.01)均有统计学差异。而种植部位、非种植部位、正常组相互间均无统计学差异(p>0.05)。4.对于输卵管妊娠的蜕膜化情况请病理学家进行评估。在输卵管非种植部位未发现有蜕膜化反应;在种植部位50%(30例中占15例)有斑片状的蜕膜反应。蜕膜化反应与hCG水平及PR没有相关性,但与ER有相关性(r=0.398,p=0.029)。5.相关分析显示:表达在TP种植部位、非种植部位、正常组中的ER和PR呈统计学正相关,而在炎症组中ER、PR之间无相关性。 第二部分白血病抑制因子在输卵管妊娠中的作用 方法:采用免疫组化、蛋白免疫印迹技术检测输卵管妊娠患者的种植部位和非种植部位(患侧输卵管)LIF的定位及半定量研究,并以分泌中期慢性炎症及正常的壶腹部输卵管为对照。 结果:1.免疫组化结果显示LIF主要表达在输卵管上皮细胞的胞浆,基质细胞淡染。种植部位的着色往往深于其对应的非种植部位。炎症组输卵管的着色较强。正常组的标本着色普遍淡。免疫组化半定量分析显示:LIF在输卵管妊娠种植部位组的表达高于非种植部位组(t=3.062,P=0.005)、正常组(P=0.002)均有统计学差异;而在炎症组、正常组、非种植部位两两之间LIF表达均无统计学差异。2.蛋白免疫印迹显示:在所有标本中均检测到分子量大约在45KDa的特异性条带。半定量分析显示LIF在种植部位的表达(2.38,0.31~6.71)高于非种植部位(0.87,0.32~4.6;t=2.871,P=0.009)和正常组(0.79,0.24~1.43;P=0.003)。但炎症组(1.39,0.55~3.99)与种植部位(P=0.381),非种植部位组与炎症组(P=0.362)、正常组(P=0.098)之间均无统计学差异。然而,LIF表达在炎症组显著高于正常分泌期组(P=0.007)。3.将种植部位与非种植部位组合并为妊娠组,发现妊娠状态下输卵管表达LIF明显高于正常组(P=0.008),但与炎症组无明显的差异(P=0.985)。 第三部分整合素β_1、α_4、α_v在输卵管妊娠母胎界面的表达 方法:采用免疫组化二步法对30例输卵管妊娠患者的种植部位和非种植部位(患侧输卵管),12例分泌中期慢性炎症输卵管壶腹部中整合素β_1、α_4、α_v的定位及蛋白的半定量研究,并以17例分泌中期正常壶腹部输卵管为对照。 结果:1.切片HE染色后,显微镜下见:种植部位有明显的绒毛侵蚀(侵蚀处输卵管黏膜上皮被破坏),与其近邻部位有正常的连续的上皮:非种植部位只有正常的输卵管黏膜上皮,无任何滋养细胞。2.免疫组化结果显示,β_1在所有的标本中均有表达,定位在输卵管上皮的胞浆、胞膜(包括基底面和腔面),基质也有少许着色。整合素β_1在炎症组的表达明显高于输卵管妊娠种植部位、非种植部位、正常组(H-score依次分别为3.54±0.51versus 2.74±1.04,2.56±0.97,2.67±1.12,相应的P=0.02,0.004,0.048),有统计学差异。而整合素β_1表达在输卵管妊娠种植部位、非种植部位、正常组中的表达相互之间无统计学异常(P>0.05)。3.整合素亚基α_4定位在输卵管上皮细胞的胞浆,基质有少许着色。整合素亚基α_v表达在腔上皮顶浆膜,基质和肌层均无表达。整合素亚基α_4、α的表达在输卵管妊娠种植部位、非种植部位、正常组、炎症组相互间均无统计学异常(P>0.05)。 第四部分血管内皮生长因子在输卵管妊娠母胎界面的表达 方法:收集输卵管妊娠的种植部位、非种植部位标本各30例,以及分泌中期正常壶腹部输卵管标本17例。采用电化学发光法检测术前血β-HCG及免疫组织化学二步法测定各组标本中VEGF的表达,根据阳性率和表达强度进行组织化学评分和相关性分析。 结果:1.种植部位输卵管黏膜上皮细胞VEGF的表达显著高于非种植部位和正常分泌期组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.非种植部位组与正常分泌期组之间VEGF表达无统计学差异(P>0.05)。3.输卵管妊娠活胎病例中种植部位、非种植部位的VEGF表达均与血β—HCG呈统计学正相关(均P<0.05)。 结论: 1.ER、PR在种植部位的下调表达似在输卵管妊娠植入中发挥重要作用。 2.蜕膜化对输卵管妊娠植入并非必须的。 3.输卵管ER/PR的升高是输卵管妊娠发生的原因之一。 4.结合LIF在宫腔内妊娠植入中的作用,提示输卵管局部高水平的LIF参与了TP的植入。 5.输卵管炎症诱发了输卵管局部LIF表达增加,显著高于正常组输卵管;输卵管妊娠种植部位LIF的表达高于非种植部位和正常组,首次证实了体内确实存在着输卵管炎症——白血病抑制因子——输卵管妊娠的联系,进一步印证了LIF在TP植入中的作用。 6.整合素亚基β_1、α_4、α_v在输卵管妊娠的种植部位、非种植部位、正常分泌期壶腹部输卵管的表达无统计学差异,不支持这三者参与输卵管妊娠植入中的相关作用。 7.VEGF在输卵管妊娠的胚泡植入和胎盘形成阶段的血管网构建中起重要作用。 8.在研究TP时,运用蛋白标记水平的种植部位较传统的病理学意义上的种植部位能更好地设立对照组,增加实验的科学性、可信性。 9.根据本研究结果首次证实了在体内输卵管局部ER/PR、LIF改变是输卵管妊娠发生的相关机制。 10.输卵管妊娠并非单纯由慢性输卵管炎诱发的机械性狭窄引起,局部着床相关因子表达的改变是另一重要的因素。


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