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重组人血清白蛋白—干扰素α 2b融合蛋白的研究

黄岩山  
【摘要】: 研究目的:利用人血清白蛋白融合技术,制备一种在体内半衰期长,生物学活性高的长效研究重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白,用于病毒性肝炎,肿瘤等相关疾病的治疗。 研究方法: 1.重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(rHSA/IFNα2b)酵母高表达菌株的构建,包括人血清白蛋白融合和干扰素α2b基因的获得,重组表达质粒的构建,毕赤酵母表达菌株的转化,筛选。 2.重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白酵母高表达菌株发酵培养条件的优化。 3.毕赤酵母表达重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白纯化方法的研究。 4.通过SDS-PAGE,等电聚焦,蛋白质杂交,氨基酸末端序列分析,质谱分析,肽谱,圆二色谱(CD)以及体外生物活性等方法对毕赤酵母表达的rHSA/IFNα2b进行结构鉴定。 5.在食蟹猴体内进行药物动力学及药效动力学研究,检测动物体内rHSA/IFNα2b后血清浓度随时间变化情况以及血清2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-OAS)的变化,并与普通IFNα2b进行比较。并研究多次给药后rHSA/IFNα2b的免疫原性情况。 结果: 1.通过PCR技术从文库中分别扩增HSA和IFN的cDNA,克隆到毕赤酵母表达载体pGENYD2中,获得含有HSA和IFN编码序列的重组质粒pGENYD2-HSA/IFNα2b,转化甲醇酵母受体菌GS115,筛选获得稳定整合、稳定表达rHSA/IFNα2b的毕赤酵母工程菌,表达形式为分泌型,摇瓶表达量大于50mg/L。 2.对影响重组毕赤酵母Pichia pastoris表达rHSA/IFNα2b的主要参数进行了摇瓶发酵试验,并根据摇瓶发酵的结果指导补料分批高密度发酵。最终确定控制甲醇浓度在0.5%之内,诱导pH5.0,温度22℃,添加0.1%吐温-80和有机培养基,发酵周期为96h对融合蛋白的发酵最优条件。在该条件下表达量最高达432mg/L。。 3.发酵液上清超滤浓缩,通过亲和柱层析、疏水柱层析、离子交换柱层析和凝胶柱层析组合纯化,纯化所得的rHSA/IFNα2b的纯度达98%以上,蛋白回收率约为25%。 4.rHSA/IFNα2b分子量为86KD,等电点为5.3,N端15个氨基酸序列及C端3个氨基酸序列与理论推测一致,产物的相对分子质量为86593.2±20.5,质量肽谱与理论序列的重叠率为75%,体外生物活性大于5.0×10~5IU/mg。 5.rHSA/IFNα2b药物代谢动力学及药效动力学研究显示,rHSA/IFNα2b皮下给药后,半衰期(t1/2)长达92小时,与IFNα-2b相比,其中t_(1/2)平均延长了19.6倍。 6.药物动力学研究显示,在单次注射rHSA/IFNα2b后,2′,5′-OAS表达显著增加而且呈量效关系,而且2′,5′-OAS活性在体内维持长达14天,相比之下,IFNα诱生的2′,5′-OAS不仅强度低,而且维持的时间也很短。 7.免疫原性实验研究发现,给药2周开始,给药动物体内产生了抗rHSA/IFNα2b抗体,并且8周时监测抗体具有中和干扰素活性作用。 结论: 1.rHSA/IFNα2b融合蛋白在毕赤酵母系统中得到了高效表达,罐上表达量大于400mg/L。表达产物经多种物理,化学和生物学方法研究证明结构正确,样品制备工艺切实可行,纯化总体收率>20%,最终产品质量符合临床研究要求。 2.食蟹猴体内进行药物动力学及药效动力学研究表明,rHSA/IFNa2b在动物体内有效的延长了半衰期,并且对诱生与IFN活性相关的2′,5′-OAS酶活性的能力显著提高,但是在食蟹猴体内有一定的免疫原性。 3.现有的研究表明,酵母表达的rHSA/IFNa2b不仅显著延长了半衰期,而且体内活性更高。因此同普通IPNa相比,临床给药频率可以延长到每两周甚至每月一次,既减少了血药浓度波动,也提高了病人依从性,从而带来更好的临床治疗效果。


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