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先天性巨结肠RET基因和PHOX2B基因多态性和肠神经元发育不良病理特点及与EC关系研究

钭金法  
【摘要】: 第一部分先天性巨结肠RET基因和PHOX2B基因多态性研究 研究背景 先天性巨结肠(Hirschsprung's disease,HD),是小儿外科常见疾病,在高加索人,非洲黑人、亚洲黄种人的发病率分别为万分之1.5、2.1、2.8,亚洲人种发病率最高。HD是一种神经嵴源性疾病,当胚胎发育过程中神经嵴细胞迁徙、分化发生停顿或发生细胞凋亡,均会导致远端肠管的神经支配异常而导致HD。近年来通过遗传连锁分析和基因敲除等技术,发现有以下基因的突变与HD的发病有关:编码有关酪氨酸激酶通路基因(包括RET原癌基因,GDNF基因,GFRα-1基因等),编码血管内皮素信号通路的基因(包括EDNRB基因,EDN3基因和ECE-1基因),编码转录因子的基因(如SOX10基因和PHOX2B基因)等。其中RET基因表达对肠神经元细胞的发育十分关键,在HD的发病中最为重要。 但对HD进行大量RET基因突变研究发现,仅有20%左右的散发性和50%左右家族性HD存在突变,而且缺乏类似肿瘤相关的热点突变,另外HD相关RET突变有不完全外显(incomplete penetrance),呈突变效应性别相关性。更为重要的是,在家族性病例,遗传连锁分析定位遗传位点在10q11.2,却仍缺乏RET编码区突变。随着SNPs疾病相关性研究的进展,对HD的RET基因研究重点逐渐转移到多态性的研究上。尚未证实单个SNPs导致HD相关RET功能改变,但可能有精确的SNPs组合(单倍型)决定调节意义。在高加索人种,发现有数个RET编码区SNPs与散发性HD相关:A45A(c135G>(?);exon 2)和L769L(c2307T>(?);exon 13)。对RET基因启动子的研究发现,在RET编码序列上游的启动子的两种多态性-5G>A和-A>C与HD相关。目前对RET基因的研究,均局限于编码区的突变及SNPs研究,虽然也有少量非编码区(内含子和启动子)的研究,但缺乏相应的功能研究。 PHOX2B基因表达研究证明,PHOX2B编码的同源域蛋白与多种非肾上腺素能神经元的发育有关,因此推断PHOX2B基因的改变可能与自主神经发育异常性疾病相关。在小鼠胚胎学研究发现,一旦成肠细胞进入到前肠间叶,即有PHOX2B蛋白表达,并贯穿肠神经元发育的始终。PHOX2B基因突变纯合子小鼠全胃肠道缺乏神经元,与HD病变相似,同时,该突变的小鼠无RET蛋白表达,因此推测PHOX2B基因可能与HD有关。Garcia-Barcelo通过对91例单纯HD研究,发现PHOX2B 1364 A>G多态性与HD有关。目前对PHOX2B基因与临床疾病的关系研究尚处在起步阶段,PHOX2B基因与HD的研究也仅有个别报道,PHOX2B基因是否参与HD的发病机制仍有待进一步的研究。 根据Hapmap组织统计数据,不同种族人群的SNPs分布频率有明显差异,RET基因和PHOX2B基因SNPs也是如此,这可能是不同种族人群HD发病率有明显差别的原因之一。本课题拟通过对浙江汉族人群HD患者和正常人群的对照研究,分析RET基因和PHOX2B基因SNPs与HD发病之间的关系,不同类型HD与基因SNPs关系,进一步推断主要的HD相关单倍型,并对照其他种族人群已有数据,分析浙江汉族人群的SNPs分布特点。同时应用免疫组化法,检测RET基因启动子多态性与RET蛋白表达之间的关系。 材料和方法 1.病例收集及标准 (1)病例组:全部病例均为本院的浙江籍先天性巨结肠患儿,共123例。根据2005年第四届国际巨结肠与相关神经嵴源性疾病会议的巨结肠诊断标准,重新阅片确定。 (2)分组及标准:将巨结肠分为短段型与长段型两种。 短段型HD:病变仅局限于乙状结肠远端,乙状结肠直肠交界及直肠。 长段型HD:病变范围包括乙状结肠近端,升结肠及累及范围更广者。 (3)正常对照组:全部正常对照组均来自本院正常体检小儿,排除消化道和神经嵴相关畸形,共194例。 全部病例及对照组抽取外周血2ml,3.8%枸橼酸钠抗凝。 本研究经浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会批准,全部患儿及对照组均获得家长知情同意。 2.PCR反应及测序 对全部样本进行DNA提取后,根据选取的SNPs,合成引物,PCR扩增,经2%琼脂糖电泳证实PCR产物后,将PCR产物进一步纯化、测序。 3.免疫组化 根据RET启动子多态性,分别选取相应患儿病理组织切片,观察神经元,确定含正常神经元蜡块,再行C-Ret免疫组化染色,将该切片镜下所有神经元按免疫组化反应等级均予计数。 4.统计方法 (1)用Hardy-Weinberg平衡定律来检验样本人群中基因频率与基因型频率是否平衡。 (2)基因和疾病的相关性分析:使用x2方检验(Chi squared),相关性以比值比(odds ratios,ORs)及其95%可信区间(confidence intervals,CIs)表示,以P值<0.05确定为统计学差异有显著性。 (3)单倍型频率用PHASE软件计算。 (4)免疫组化结果用非参数统计中的两样本等级和检验(Mann-Whitney Test)。 结果 1.各位点基因型与HD风险 RET基因-5G>A,-1A>C,c135G>A,c2307T>G四个位点的少见基因型AA,CC,AA,GG在HD组频率明显高于对照组(P<0.05)。 PHOX2B基因1364A>G两组间未发现有基因型差异。 2.各位点等位基因频率与HD风险 RET基因-5A,-1C,c135A,c2307G在HD组等位基因频率明显高于对照组(P<0.05)。 PHOX2B基因1364A>G等位基因分布未发现显著性事件。 3.各位点等位基因频率与HD类型关系 RET基因各位点均未发现等位基因频率在不同类型间的差异。 4.单倍型与HD RET基因启动子单倍型-5A/-1C占HD组82.5%,较对照组差异有显著性(P<0.05)。 RET基因四位点(-5,-1,c135,c2307)单倍型ACAG占HD组75.2%,较对照组差异有显著性(P<0.05)。 5.不同种族人群之间各等位基因频率 RET基因-5A、c135A和c2307G等位基因频率明显高于高加索和非洲人种(P<0.05) 6.RET基因启动子多态性与RET蛋白表达关系 RET基因启动子基因型-5AA/-1CC较其他基因型RET蛋白表达降低(P<0.05)。 启动子单倍型-5A/-1C纯合子较-5A/-1C杂和子RET蛋白表达降低(P<0.05)。 结论 1.RET基因-5G>A,-1A>C,c135G>A,c2307T>G四个位点多态性与浙江汉族人群HD明显相关,但与HD类型无明显相关。 2.RET基因-5G>A,-1A>C,c135G>A,c2307T>G四个位点单倍型ACAG是浙江汉族人群的HD相关核心单倍型。 3.浙江汉族人群的RET基因-5、c135和c2307位点的少见等位基因频率较其他人种有明显增高。 4.RET启动子多态性对启动子功能有影响,与RET蛋白表达相关。 5.未发现PHOX2B基因多态性与浙江汉族人群HD相关。 第二部分肠神经元发育不良病理特点及与EC关系研究 研究背景 近年来逐渐认识到一类临床表现与HD十分相似,但病理改变与HD明显不同的疾病,称之为巨结肠同源病(allied disorders of Hirschsprung's disease;ADHD),主要包括肠神经元发育不良(Intestinal neuronal dysplasia;IND)、神经节细胞减少症(Hypoganglionosis)、神经节细胞未成熟症(Immaturity of ganglion cells)等。1994年Holschneider和Meier-Ruge将HD和ADHD两者统称为肠神经元异常(Neuronal intestinal malformations;NIM),并进行了详细的病理分类。在ADHD中以IND最为常见,其病理特点主要有以下4项:①粘膜下和肌间神经丛增生,形成巨大神经节(giant ganglia),粘膜下丛节细胞数目≥7个(正常为3~5个),肌间丛面积≥正常的3倍,常伴有神经元不成熟现象;②粘膜固有层和环肌副交感神经纤维乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,Ache)活性增高:③粘膜固有层和粘膜肌层分散的平滑肌纤维之间有孤立的神经节细胞;④肌间神经丛交感神经发育不全或无发育。 混合型IND的临床表现几乎与HD一样,单纯型IND的发病主要集中在年幼儿童,而在新生儿期较少表现。临床表现为渐进性的便秘,腹胀或有顽固性/发作性的吸收异常。部分患儿经保守治疗或随年龄增长能逐渐好转,部分患儿则呈进行性加重,需手术治疗。 针对HD的辅助检查中,包括钡剂灌肠、直肠肛管测压,IND常缺乏特征性的改变而无法准确应用。目前国内对1ND的认识仍不足,一般根据临床表现或结合钡剂灌肠检查就予诊断并进一步手术治疗,随着经肛门手术的广泛开展和手术年龄提前至新生儿和婴幼儿期,单凭临床表现和钡灌肠可误将部分单纯型IND诊断为HD而手术治疗。 虽然IND作为一种明确的病理改变已经得到广泛认同,对IND是否作为一种独立的疾病一直存在争议,分歧的焦点在于IND是一种原发性疾病还是继发性改变,两者都有相应的证据支持。IND的诊断标准仍存在争议,Meier-Ruge提出了改良的粘膜活检来诊断IND,但行多处肠壁的全层病检,HE染色或Ache染色,对神经元发育不良较难判断的,加行神经元相关免疫组化检测的方法较为公认。 对IND的手术指征和切除标准仍不确定,大部分的单纯型IND可以根据病情适当的保守治疗(如改变饮食结构,应用缓泻剂等)和临床观察,随生长发育部分患儿不手术也可以自行好转甚至自愈,在一定条件下(如肠造瘘),IND病变可以自行再发育为成熟的神经元细胞而恢复功能。但对严重腹胀,小肠结肠炎患儿仍需及时手术治疗,局限型IND,可以将病变肠段全部切除,以达到较好的手术效果;而对广泛性病变,仍缺乏切除范围的明确标准,可先行回肠造瘘术,营养情况改善后再行进一步根治术,有报道切除小部分病变结肠到全部结肠(甚至部分小肠)。 临床常见部分患儿巨结肠术后恢复良好,而部分患儿术后一段时间内仍有反复EC,甚至需要再次肠造瘘。术后EC是否与伴发IND病变有关?本课题拟通过对IND与HD的临床和病理资料的统计,研究术后EC和神经元形态、分布的关系。虽然对IND的光镜下病理特点有较多报道,但发育不良神经元的超微结构特点仍缺乏研究,这也是本课题的研究目的。同时,并通过对IND的NSE、Cathepsin-D和S-100的免疫组化染色,分析对IND的镜下免疫组化特点和有效的诊断手段。 材料和方法 1.IND的神经元分布与EC特点 (1)研究对象及临床资料收集:收集2001年~2004年本院诊断的巨结肠手术治疗的患儿,共347例。进行随访(≥6月),评价患儿术后排便,腹胀情况,术后EC发生情况(以随访时间≥6月,发生≥2次EC为反复EC);是否有再次手术。 (2)组织切片阅片、分类:根据患儿的病理号,调取所有患儿病理切片,每个病理号一般有4~6张切片,分别标记为A、B、C、D、E、F等,对应取材部位从大体标本痉挛段—移行段—扩张段—切缘,其中首尾编号分别对应痉挛段和切缘。重新阅片后,参照Holschneider提出的有关神经元异常的病理诊断标准进行分类。 2.免疫组化染色 根据组织切片结果,调取20例IND病变组织蜡块,同时取5例HD患儿神经元正常肠段组织和2例美克尔憩室肠切除边缘组织,分别进行NSE、Cathepsin-D和S-100免疫组化检测。 3.透射电镜检查 (1)研究对象及取材:巨结肠术中切除肠段立即取材,切取小块肠壁组织,在2.5%戊二醛液体覆盖下,进一步切割组织尽可能小,估计保留肌间组织和两侧部分肌层。样本置2.5%戊二醛4℃保存,根据病理结果,将所需样本分类:神经元正常肠段和IND病变肠段。 (2)戊二醛—锇酸双重固定,脱水,浸透,包埋,固化,预切片定位,超薄切片,电镜观察、拍片、记录。 4.数据处理 统计所有HD、IND和HD/IND病变患儿临床资料,病理结果,采用x~2检验行统计学分析,P<0.05认为差异有统计学意义。 结果 1.IND的神经元分布与EC特点 (1)临床随访结果:获有效随访(≥6月)324例。根据组织类型,对其中HD210例,IND38例,HD伴IND(HD/IND)45例共293例患儿作为本课题研究对象。术后反复EC共41例,再次手术8例。 (2)病理观察结果:IND和HD/IND的异常神经元分布与典型HD不同,在扩张段和切缘都有较高比例的异常神经元分布(P<0.01)。 (3)IND与EC关系:IND和IND/HD组的术后反复EC发生率高于典型HD组(P<0.01)。切缘IND病变组术后反复EC发生率明显高于切缘神经元正常组(P<0.01)。经肛门手术与经腹手术的术后反复EC发生率分别为18.1%和8.7%(P<0.05)。 (4)再次手术与病理类型:有8例患儿术后因仍有反复腹胀、便秘或严重的EC再次行手术治疗,5例为切缘有IND(其中4例HD/IND,1例IND),有3例为HD第一次术后切缘仍无神经元细胞。 2.IND的免疫组化特点 NSE免疫组化结果:粘膜下神经丛和肌间神经丛均有显色,神经丛胶质细胞、神经元细胞和神经纤维均呈阳性反应。IND病变肠段粘膜下及肌间均有巨神经丛,丛内各成分细胞均呈阳性反应,神经丛内有大量大小不等细胞,为胶质细胞与发育不良神经元,其中可见部分细胞胞体较大。 Cathepsin-D免疫组化结果:神经丛内仅神经元细胞胞浆呈阳性反应,神经纤维和胶质细胞均呈阴性反应。IND病变可见巨神经丛内有大量神经元细胞,形态较正常小,胞浆少,染色较深,细胞核较正常小,染色深,核仁有或不明显。 S-100免疫组化结果:神经丛内神经纤维和胶质细胞呈阳性反应,神经元细胞反应呈阴性。IND病变可见巨神经丛内布满大小不一的缺损区,缺损区中央可见发育不良细胞核,神经纤维增生不明显。 3.IND透射电镜下特点 正常神经元细胞直径约20~30gm,细胞形态较不规则,胞浆丰富,胞浆内可见清晰的线粒体、光面内质网和粗面内质网,伴有大量的神经内分泌囊泡结构,囊泡内可见递质颗粒。细胞核直径约7~8μm,细胞核较为规则,核膜完整。核仁明显,核内染色质疏松,分布均匀。 IND病变神经元细胞直径约10~15μm,细胞形态较为规则,胞浆较正常神经元明显减少,胞浆内可见清晰的线粒体、光面内质网和粗面内质网,但神经内分泌囊泡结构很少或没有。细胞核直径约4~5μm,圆或椭圆,核膜完整,往往局部有不规则突起,核仁有或没有,核染色质分布不均,有边聚现象。 结论 1.IND的病变神经元分布与肉眼病变肠段分布有不平衡性,术后EC发生率高,切缘仍有IND病变以及经肛门手术是术后反复EC的危险因素,IND的切除范围仍有不确定性。 2.NSE、Cathepsin-D和S-100三种免疫组化具有互补性,可以分别显示IND的神经丛结构,神经丛内神经元结构数量,神经丛神经纤维增生情况,从而能够对IND进行准确的判断。 3.电镜下,IND病变神经元结构与正常不同,胞浆内神经内分泌囊泡的减少或缺乏,伴有核染色质边聚现象。


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