和厚朴酚逆转P-gp介导的肿瘤多药耐药及协同、增敏化疗药物杀伤肿瘤细胞的体内外药效研究

【摘要】： 研究背景： 肿瘤的多药耐药与化疗的毒副反应是临床上制约恶性肿瘤患者化疗的疗效从而影响生存与预后的两个严重问题。 多药耐药(Multidrug Resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构和作用机理不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性，是导致化疗失败的主要原因。临床上对于肿瘤MDR及其预防与逆转的研究主要集中在药物转运泵上，即我们通常所称的耐药蛋白。P-gp为其中最重要的一种耐药蛋白，是引起大多数化疗药物MDR的主要原因。研究肿瘤MDR及其预防与逆转是肿瘤化疗中凾待解决的问题，亦是目前肿瘤研究的难点及热点领域。 此外，肿瘤化疗中凾待解决的另一件事就是化疗药物的毒副反应问题。由于毒副反应的出现直接导致患者对化疗药物“可耐受的最大剂量”不断的降低，严重时甚至需中断化疗。因而药物的毒副反应已成为了制约化疗药物用药剂量从而制约化疗效果的重要因素。如何让化疗药物增效减毒是目前肿瘤化疗中凾待解决的另一个问题。 由于中药具有的独特优势，从中药中筛选高效、低毒的单体化合物用于MDR逆转及化疗增效减毒已成为当前肿瘤化疗研究的热点。和厚朴酚是从传统中药厚朴中提取出来的一种主要活性成分，在前期的工作中，我们发现和厚朴酚可以诱导人结肠癌RKO细胞发生非P53依赖性的凋亡；并能有效的抑制RKO细胞裸鼠移植瘤的生长。前不久，我们研究小组还报道了高浓度的和厚朴酚可以诱导多种肿瘤细胞产生线粒体介导的可调控的非凋亡性死亡方式。 此外，与本论文密切相关的是，我们通过前期的体外筛选实验发现了和厚朴酚具有逆转肿瘤MDR的作用，进一步的分子实验还发现，其可以下调耐药蛋白P-gp的上游调控靶点HIF-1α的表达。而直至本研究开始前，尚无文献报道和厚朴酚可以逆转或预防P-gp相关的肿瘤多药耐药；此外，和厚朴酚与化疗药物联用能否起协同作用或增敏作用也没有人作出过探讨。 研究目的： 明确和厚朴酚对于肿瘤多药耐药细胞P-gp功能和表达的确切作用及其恢复耐药细胞对于化疗药物敏感性的效果；研究和厚朴酚是否可以预防阿霉素诱导引起的肿瘤细胞耐药性产生；分析和厚朴酚与常见化疗药物联用时产生的具体效应及增敏化疗药物杀伤肿瘤细胞的确切效果；通过建立荷耐药移植瘤裸鼠模型来明确和厚朴酚联合阿霉素治疗耐药肿瘤细胞移植瘤的体内药效。 研究内容： 本论文主要研究内容如下： 1．和厚朴酚逆转及预防P-gp介导的肿瘤多药耐药的药效及机理研究 1．1和厚朴酚对耐药细胞P-gp功能的影响 Rh-123是特异性的P-gp底物，是指示P-gp功能的常用荧光物质。我们用和厚朴酚对细胞进行不同时间的预处理，然后用Rh-123积聚实验来反映P-gp功能的变化。结果显示，在和厚朴酚短时间(24小时以内)的预处理下，Rh-123积聚水平无明显提高；当预处理时间达到48小时才出现Rh-123积聚水平的显著升高。以上结果提示和厚朴酚对耐药细胞P-gp功能无直接的抑制作用。 1．2和厚朴酚对耐药细胞P-gp及mdr1 mRNA表达水平的影响 和厚朴酚分别处理MCF-7／ADR细胞12，24，48与72 hrs后，我们采用流式细胞仪检测细胞P-gp表达的变化情况。结果显示，随着和厚朴酚处理时间的延长，细胞表面P-gp的表达逐步下降，其呈时间依赖性下调细胞P-gp表达。随后，进一步的研究显示和厚朴酚也可呈剂量依赖性下调细胞P-gp表达。 进而我们采用Real-time PCR检测MCF-7／ADR细胞mdr1 mRNA表达水平的变化。结果发现和厚朴酚同样可呈剂量依赖性下调细胞mdr1 mRNA表达。 1．3和厚朴酚对于MCF-7／ADR细胞Rh-123积聚和外排的作用 我们采用流式细胞术检测细胞对Rh-123积聚与外排水平。结果发现，用5.2μg／ml(约20μM)浓度的和厚朴酚处理过48小时的MCF-7／ADR耐药细胞对于Rh-123的积聚水平明显高于空白对照组细胞，Rh-123的外排水平则明显低于空白对照。和厚朴酚可以增加MCF-7／ADR细胞对Rh-123的积聚并减少外排。 1．4和厚朴酚可部分恢复MCF-7／ADR细胞对于阿霉素的敏感性 MTT检测结果显示，经过5.2μg／ml浓度的和厚朴酚预处理后，MCF-7／ADR细胞对阿霉素的敏感性显著提高：细胞对阿霉素的IC50从17.7±4.9μg／ml(无预处理组)下降至6.2±1.9μg／ml(预处理组)，降低了将近3倍。 1．5和厚朴酚预防阿霉素诱导引起的肿瘤细胞耐药性产生的作用 我们选取了和厚朴酚、姜黄素、五味子乙素等数种天然药物单体进行本部分的实验。结果发现经和厚朴酚预处理后，并不能有效地抑制阿霉素诱导引起的K562敏感细胞mdr1 mRNA与P-gp表达水平上调，两者的表达水平与单用阿霉素诱导组细胞相比无明显差异。 2．和厚朴酚与化疗药物联用后联合效应的分析与增敏作用研究 2．1利用联合指数(CI)分析和厚朴酚与化疗药物的联合效应 通过CI的计算，我们发现除VP-16与和厚朴酚联合处理MCF-7细胞组外，其余处理组不论是耐药肿瘤细胞还是非耐药细胞，经药物联合处理后均能产生一定程度的协同效应；且对于耐药细胞组协同效应较非耐药细胞组明显。 2．2利用剂量下降指数(DRI)研究和厚朴酚对化疗药物的增敏作用 我们通过剂量降低指数(DRI)的计算来反映出加用固定浓度的和厚朴酚后，在杀伤肿瘤细胞效果不变的前提下化疗药物浓度可以降低的倍数。结果发现，除VP-16处理MCF-7细胞组外，其余处理组不论是耐药肿瘤细胞还是非耐药细胞经加用固定浓度的和厚朴酚外，均能明显增敏相应化疗药物杀伤肿瘤细胞的效果，DRI提高明显。 3．和厚朴酚联合阿霉素治疗荷耐药肿瘤细胞移植瘤裸鼠的体内药效研究 体内实验发现，和厚朴酚可增强阿霉素抑制MCF-7／ADR耐药细胞移植瘤体积增长的作用，联合用药后18天时移植瘤平均瘤体体积比单用阿霉素组减小约21.71％，差异有显著性(P＜0.05)；同时，和厚朴酚联合阿霉素应用还可延长荷瘤裸鼠的平均生存时间。 研究结论： 1．和厚朴酚可逆转P-gp介导的肿瘤多药耐药，从而部分恢复耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；和厚朴酚可能是通过降低mdr1 mRNA的表达水平进而下调P-gp； 2．和厚朴酚可协同或增敏多种化疗药物杀灭耐药及非耐药肿瘤细胞； 3．和厚朴酚与阿霉素联合可显著抑制人耐药肿瘤细胞移植瘤体积的增长，并延长荷瘤裸鼠生存时间。