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肝癌衍生生长因子(HDGF)在胃癌的表达及其对胃癌AGS细胞影响机制的研究

毛建山  
【摘要】: 胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,胃癌死亡居恶性肿瘤死亡的第二位。随着近年外科技术的改进,早期胃癌术后5年生存率已达90%以上,然进展期胃癌患者的5年生存率仍只有5%~15%,因此要提高胃癌的治疗效果,降低胃癌死亡,除要提高早期胃癌的诊断率,还要发展新的更有效的治疗手段。阐明胃癌发病的分子机制,有助于筛选特异性的分子靶点,对预防和降低胃癌发病有重要意义。 胃癌多从癌前病变发展而来,de novo癌直接从正常的黏膜发展而来。胃黏膜的癌变过程是一个多因素、多步骤、内外因交互并作用于正常胃干细胞,经诱癌、促癌及演进多阶段的结果。对胃的各级癌前病变和癌组织的分子变化研究结果显示,在胃粘膜上皮癌变多阶段演进过程中,发生许多不同的分子改变,存在癌基因的突变性激活和/或抑癌基因的杂合性缺失,从癌前病变到胃癌的演进过程中还伴有DNA损伤修复基因的突变以及其他表基因改变。细胞的增殖异常是肿瘤发生发展过程中的最早期事件。 肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor,HDGF)是一种肝素结合的生长因子,最初从人肝癌HuH-7细胞系无血清培养的上清液中分离得到。HDGF参与肝、肾、肺、血管等多种胚胎组织的生长发育,在这些组织器官中高表达,出生后表达明显减低;HDGF具有有丝裂原作用,进入细胞核经核锚着后促进胎肝细胞、肝癌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等的增殖生长;HDGF也是一种旁分泌和自分泌生长因子,促进自身和邻近细胞的增殖。还发现HDGF具有神经营养作用,对神经细胞具有促存活效应。近年研究示HDGF与肿瘤的发生、发展关系密切。在鼠自发性肝细胞肝癌癌变演进过程中,HDGF在癌变后表达明显升高;HDGF在肝癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌等肿瘤组织中表达增高,且其表达与预后相关。然迄今对HDGF参与肿瘤发生发展的分子作用机制尚不明了。阐明HDGF参与肿瘤发生发展的分子作用机制对进一步的干预有意义。 本研究先采用免疫组织化学的方法研究HDGF在胃癌患者的胃癌组织及配对癌旁组织的表达情况,以评价HDGF表达与胃癌临床病理特征、胃癌演进过程的关系和意义;然后构建HDGF真核表达载体转染胃癌AGS细胞,观察高表达HDGF对AGS细胞生物学行为和细胞信息通路中关键分子活性的影响;最后用特异性siRNA“knockdown”HDGF后观察对AGS细胞凋亡的影响及其关键分子改变。以探讨HDGF对胃癌细胞生物学行为的影响和其分子作用机制,HDGF作为胃癌诊治靶点的可能性。 结果: 1.HDGF参与人胃癌的发生和演进过程 采用EnVision二步免疫组织化学的方法研究HDGF在205例胃癌患者的胃癌组织及配对癌旁组织的表达,结果显示细胞核HDGF的表达在胃黏膜的癌变进程中是一个逐渐升高的过程,在胃的良性疾病浅表性胃炎、萎缩性胃炎的胃黏膜细胞核的HDGF不表达或表达很低,在胃癌的癌前病变肠上皮化生、不典型增生阶段开始增高,P均<0.01;早期胃癌阶段有进一步增高,早期胃癌高于与肠上皮化生P<0.01,早期胃癌与不典型增生比较无差异,p=0.247;在进展期胃癌比早期胃癌更高,P<0.01。胃癌组织细胞核HDGF的表达与胃癌患者的有无淋巴结转移、浸润深度、UICC分期相关(P<0.05)。提示HDGF表达与胃癌患者的预后相关。结果表明HDGF表达在胃癌发生发展过程中的早期阶段就可增高并与胃癌发生发展过程有关。 2.高表达HDGF通过Erk1/2途径促进胃癌AGS细胞增殖 观察HDGF高表达对胃癌细胞生物学行为的影响,与AGS细胞和稳定转染pcDNA3.1空质粒的AGS细胞(pcDNA-AGS)比较,稳定表达HDGF的AGS细胞(HDGF-AGS)在无血清存在时,其可维持细胞较明显的增殖能力,P均<0.05;然而,在存在15%血清的情况下,则三组细胞增殖无明显差异,P均>0.05。用不同浓度的顺铂以抑制细胞增殖时发现,HDGF-AGS细胞对顺铂更具抵抗性,而pcDNA-AGS细胞与空白AGS细胞无明显差异。Western blot检测发现与AGS细胞和转染pcDNA3.1空质粒的AGS细胞比较,瞬时转染HDGF后增加了MAPK通路中总Erk1/2和磷酸化Erk1/2蛋白的表达水平,而对p38、JNK/SAPK的影响不明显;转染HDGF虽增加了总Akt的表达水平,然而磷酸化的Akt呈下调趋势;用ELISA法对细胞核蛋白分别检测p65、p52、p50、Rel-B和Rel-C表明,三组细胞p65、p52、p50、Rel-B和Rel-C无显著差异,P均>0.05。用Westen blot分析Bcl-2/Bcl-xl/Bad通路发现HDGF激活的Erk1/2并不活化Bcl-2/Bcl-xl/Bad通路。芯片检测示HDGF上调了转录因子T-box 18和b-LHL。用体外软琼脂克隆形成实验和体外细胞侵袭实验来验证稳定表达HDGF的AGS细胞(HDGF-AGS)是否更具转移潜能。结果发现(HDGF-AGS)细胞在体外软琼脂克隆形成实验中尽管细胞克隆形成数与对照的稳定转染pcDNA3.1空质粒的AGS细胞和空白AGS细胞无明显差异(P>0.05,ANOVA),但形成的细胞克隆团较对照组大;在体外细胞侵袭实验中发现无论在无血清还是在15%血清情况下,通过Matrigel的细胞数在稳定表达HDGF的AGS细胞、对照的稳定转染pcDNA3.1空质粒的AGS细胞和空白AGS细胞无明显差异(P>0.05,ANOVA)。 3.沉默HDGF增加TRAF-2/c-IAP抑制性复合物而抑制胃癌AGS细胞的凋亡 用特异性siRNA沉默HDGF后,AGS细胞在软琼脂克隆形成能力减弱。FCM分析发现沉默HDGF并不增加细胞的凋亡,然而在0.06125μg/ml顺铂条件下,HDGF沉默组细胞显示了明显的凋亡抑制。进一步用Western blot检测表明HDGF沉默AGS细胞增加了磷酸化Bcl-2和Bad的表达,而Bad Ser112和Ser136磷酸化水平与空白对照组和空脂质体转染组比较无显著差异。其他Bcl-2分子在HDGF沉默组和对照组之间表达无显著差别。用TRAF2抗体进行的免疫共沉淀检测表明与空白对照组和空脂质体转染组比较,HDGF沉默细胞能被TRAF2抗体“下拉”的c-IAP1量更大,而TRAF2、c-IAP1和XIAP空白对照组和空脂质体转染组比较,均无明显改变。 结论: 1.细胞核HDGF表达在胃黏膜的癌变进程中是一个逐渐增高的过程,HDGF表达在胃癌发生发展过程中的早期阶段就可增高并与胃癌发生发展过程有关,HDOF的表达水平与胃癌患者的预后相关; 2.高表达HDGF通过Erk1/2途径促进胃癌AGS细胞增殖,但不增加AGS细胞的体外侵袭能力; 3.沉默HDGF表达抑制AGS细胞在软琼脂中的非锚着生长,沉默HDGF增加磷酸化Bcl-2和Bad的表达及增加TRAF-2/c-IAP抑制性复合物而抑制顺铂诱导的胃癌AGS细胞的凋亡。


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