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血管生成素2在口腔鳞癌形成中的作用及有关机制研究

陈海红  
【摘要】: 实体瘤的生长依赖肿瘤血管,从周围已存在的血管中经过芽生形成新的血管谓之血管生成。血管生成素(Angiopoietins,Angs)是近年来发现的继内皮细胞生长因子和酪氨酸激酶受体(VEGF/KDR)之后的另一类与血管生成密切相关的一大家族,不仅在胚胎血管发育和多种生理状态下的血管生成中发挥调节作用,还与肿瘤、炎症、创伤等病理状态下的血管生成密切相关,但其效应和作用机制尚在不断的探索之中。 血管生成素家族是一个既含受体激动剂又含受体抑制剂的促血管生成家族,现已发现4个成员:Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4,均能识别内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体Tie-2,但效应截然不同。Ang-1通过激活Tie-2,起到稳定血管,维持血管壁完整性和调节血管功能的作用。Ang-2则通过抑制Tie-2的磷酸化,离断血管内皮细胞与周细胞的结合,破坏血管稳定性,从而参与血管重塑和内膜去稳定作用,与肿瘤新生血管的生成密切相关。 目前已检测到Ang-2在多种肿瘤组织中表达增高,如:胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、胶质瘤、前列腺癌,卵巢癌等,且其表达强度与肿瘤血管形成的数目,临床分期、淋巴结转移、预后相关。有人用Ang-2转基因的胃癌细胞和结肠癌细胞建立动物实验模型,结果表明Ang-2的高表达能促进肿瘤的生长、转移,目前多数实验均支持这一结果;但也有人用Ang-2转基因的Lewis肺癌及TAS乳癌细胞接种小鼠,发现Ang-2的高表达能促进血管内皮细胞和肿瘤细胞凋亡,破坏肿瘤血管的完整性,从而抑制肿瘤的生长、转移,这说明Ang-2在不同的肿瘤组织中所起效应不一样。最新观点认为,Ang-2在肿瘤形成中有促血管退化和启动血管新生的双重作用,特别是与血管内皮细胞生长因子(VEGF)的存在与否密切相关。其具体效应怎样?可能与哪些机制有关?在其作用过程中和其它促、抑血管生成因子间的相互作用如何?这些均需进一步探索。 口腔颌面部肿瘤血供丰富,早期易于血道、淋巴道转移,综合国内、外文献,Ang-2在口腔颌面部肿瘤生长、转移中的作用罕见报道,本课题将检测Ang-2在口腔颌面部鳞癌组织中的表达,分析其表达强度与临床生物学行为的关系,并建立Ang-2转基因的Tca8113舌鳞癌裸鼠移植瘤模型,以进一步探讨Ang-2在口腔鳞癌生长中的作用,及其与VEGF、基质金属蛋白酶、一氧化氮等其它促血管生长因子之间的关系。 第一部分血管生成素2在口腔颌面部鳞癌中的表达及意义 一、研究目的 检测Ang-2在口腔颌面部鳞癌中的表达,并分析其表达强度与淋巴结转移、肿瘤分期等临床生物学行为的关系,以初步了解Ang-2在口腔颌面部恶性肿瘤生长中的作用。 二、材料方法 1.组织标本 选取2003.5——2006.5浙江大学医学院附属第一医院口腔外科手术切除的口腔颌面部鳞癌组织及癌旁无瘤组织。 2.方法 (1)实时荧光定量法检测Ang-2 mRNA,VEGF mRNA在口腔颌面部鳞癌中的表达。 (2)免疫组化半定量法检测Ang-2、VEGF蛋白在口腔颌面部鳞癌中的表达。 三、结果 1.Ang-2 mRNA、VEGF mRNA在口腔颌面部鳞癌中的表达 Ang-2 mRNA,VEGF mRNA在癌组织中的表达为6.86±1.37、9.36±2.75,在癌旁无瘤组织中的表达为7.95±2.08、11.03±2.67,差异有显著意义(P<0.05)。 2.Ang-2、VEGF蛋白在口腔颌面部鳞癌中的表达 Ang-2、VEGF阳性染色定位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆和胞膜中,肿瘤组织中的Ang-2、VEGF蛋白合成明显活跃,半定量计分法提示Ang-2、VEGF蛋白在肿瘤组织中的阳性表达率为53.57%、60.71%;在癌旁无瘤组织中的阳性表达率为24.00%、28.00%,差异有显著意义(P<0.05) 3.Ang-2表达强度与口腔颌面部鳞癌临床生物学行为的关系 Ang-2 mRNA在淋巴结转移阴性和阳性组的表达分别为7.07±1.50、6.60±1.21;在Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ的不同临床分期组的表达分别为7.17±1.58、6.59±1.14,差异均无显著意义(P>0.05)。 四、结论 1.Ang-2 mRNA、VEGF mRNA在口腔颌面部鳞癌中的表达高于癌旁无瘤组织。 2.Ang-2、VEGF蛋白在口腔颌面部鳞癌中的表达高于癌旁无瘤组织,两者不仅定位于血管内皮细胞,也定位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜中,提示共同参与了口腔颌面部肿瘤血管的形成。 3.Ang-2的表达强度与淋巴结转移及临床分期无明显相关性,这一点需要更大的样本量进一步研证。 第二部分血管生成素2对舌鳞癌裸鼠移植瘤的成瘤影响 一、研究目的 为进一步探讨Ang-2在口腔颌面部肿瘤中的成瘤效应,本实验旨在构建Ang-2转基因的Tca8113舌鳞癌细胞系,观察Ang-2对舌鳞癌裸鼠体内成瘤的影响。 二、研究方法 1.实验动物、细胞和主要试剂 (1)裸鼠:6周龄健康雌性BALB/C裸鼠27只,分三组。 (2)细胞株:人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113,购自上海第二医科大学附属第九人民医院口腔生物研究所。 (3)克隆质粒pBLAST49-hANGPT-2:购于Invivogen公司。 2.方法 (1)构建pcDNA3.1(-)B/Ang-2重组表达质粒。 (2)脂质体转染法:pcDNA3.1(-)B/Ang-2导入Tca8113细胞系,G418筛选稳转Ang-2基因的Tca8113细胞,并以RT-PCR及qRT-PCR法检测Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B、Tca8113三组细胞中Ang-2基因的不同表达。 (3)裸鼠移植瘤建立:3×10~6个肿瘤细胞接种于裸鼠背部皮下,观察移植瘤的成瘤时间及生长。 (4)免疫组织化学法:检测各组肿瘤组织内Ang-2蛋白的表达。 三、结果 1.pcDNA3.1(-)B/Ang-2重组表达质粒的成功构建 Ang-2全长cDNA纯化产物在T4连接酶的作用下与pcDNA3.1(-)B载体进行体外基因重组,构建pcDNA3.1(-)B/Ang-2重组表达质粒。经酶切法及核酸双向测序法鉴定其内含hAng-2基因。 2.稳转Ang-2基因的Tca8113细胞系的成功建立 pcDNA3.1(-)B/Ang-2及pcDNA3.1(-)B通过脂质体转染法转入Tca8113细胞系,RT-PCR结果证明只有Tca8113/Ang-2细胞显示Ang-2阳性条带,qRT-PCR分析进一步检测到Tca8113/Ang-2细胞中Ang-2mRNA的表达量是内源性Ang-2mRNA表达的7690倍。 3.Ang-2转基因的Tca8113细胞裸鼠移植瘤的成功建立 免疫组化结果显示:在Tca8113/Ang-2组,大量Ang-2阳性染色定位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜中,而在Tca8113/pcDNA3.1(-)B、Tca8113组只有少量散在、稀疏的淡黄色染色,进一步从蛋白质水平证实了Ang-2转基因的舌鳞癌裸鼠移植瘤的成功建立。 4.转基因表达的Ang-2对舌鳞癌移植瘤成瘤时间的影响 Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B、Tca8113组的平均成瘤时间分别为13.0、4.7和5.1天,可见Ang-2转基因组成瘤时间长于对照组(P<0.05)。 5.转基因表达的Ang-2对舌鳞癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 Tca8113/Ang-2组肿瘤生长速度较Tca8113/pcDNA3.1(-)B、Tca8113组明显滞后(P<0.05)。5周后平均瘤重分别为0.531±0.398g、1.427±0.903g、1.552±0.663g,Tca8113/Ang-2组瘤重较未转染组明显降低,差异有显著意义(P<0.05)。 四、结论 1.成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(-)B/Ang-2,及Ang-2稳转的舌鳞癌细胞系Tca8113/Ang-2,在此基础上建立的Ang-2转基因的舌鳞癌Tca8113裸鼠移植瘤可作为研究Ang-2在口腔肿瘤中作用的理想动物模型。 2.转基因表达的Ang-2延长了舌鳞癌Tca8113裸鼠移植瘤的成瘤时间。 3.转基因表达的Ang-2抑制了舌鳞癌Tca8113裸鼠移植瘤的生长。 第三部分血管生成素2抑制舌鳞癌裸鼠移植瘤生长的有关机制探讨 一、研究目的 进一步研究Ang-2抑制肿瘤生长的有关机制,如:Ang-2对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响;对肿瘤血管形态及微血管密度的影响;及对其它血管生成因子(VEGF、MMP-2、MMP-9、iNOS、eNOS)生成的影响。 二、材料方法 1.组织标本 第二部分实验留置的Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B、Tca8113三组裸鼠移植瘤组织。 2.方法 (1)Real time RT-PCR法:检测肿瘤组织内VEGF、MMP-2、MMP-9、iNOS、eNOS mRNA的表达。 (2)免疫组化法:检测肿瘤组织内增殖细胞核抗原(PCNA)、α-肌动蛋白(α-SMA)、FⅧ。 (3)TUNEL法:检测肿瘤细胞凋亡。 三、结果 1.转基因表达的Ang-2对肿瘤血管的形态,及微血管密度(MVD)的影响Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B和Tca8113三组MVD分别为5.88±1.46、5.33±2.00和5.86±2.41,差别无显著意义。但Tca8113/Ang-2组血管周围α-SMA的表达稀少,提示血管壁不完整。 2.转基因表达的Ang-2促进了肿瘤细胞的凋亡 免疫组化法检测Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B和Tca8113三组肿瘤细胞的PCNA标记指数分别为34.63±9.40%、57.61±12.26%和54.71±12.82%,Tca8113/Ang-2组较两对照组下降(P<0.05),TUNEL检测显示Tca8113/Ang-2组肿瘤组织内凋亡标记指数(19.00±5.48%)较Tca8113/pcDNA3.1(-)B组和Tca8113组增高(10.22±3.42%、10.71±3.30%),差别有显著意义(P<0.05)。 3.VEGF mRNA在各组移植瘤中的表达 实时荧光定量法检测VEGF在Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B和Tca8113三组肿瘤组织内表达为4.37±2.73、4.63±2.96和5.09±3.94,差别无显著意义(P>0.05)。 4.MMP-2、MMP-9 mRNA在各组移植瘤中的表达 MMP-2 mRNA在Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤组织中的表达分别为6.84±3.01、6.76±4.17、8.27±5.24;MMP-9 mRNA在Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤组织中的表达分别为8.57±5.13、7.76±4.20、9.23±6.10,差异均无显著意义(P>0.05)。 5.iNOS、eNOS mRNA在各组移植瘤中的表达 iNOS mRNA在Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤组织中的表达分别为8.68±5.89、10.13±4.85、9.78±5.76;eNOS mRNA在Tca8113/Ang-2、Tca8113/pcDNA3.1(-)B和Tca8113移植瘤组织中的表达分别为10.55±1.77、12.18±2.43、10.78±3.51,差异均无显著意义(P>0.05)。 四、结论 1.转基因表达的Ang-2破坏了舌鳞癌Tca8113裸鼠移植瘤血管的形态,对微血管密度无明显影响。 2.转基因表达的Ang-2抑制了舌鳞癌Tca8113裸鼠移植瘤细胞的增殖、促进了肿瘤细胞的凋亡。 3.转基因表达的Ang-2对舌鳞癌Tca8113裸鼠移植瘤中VEGF mRNA的表达无明显影响。 4.转基因表达的Ang-2对舌鳞癌Tca8113裸鼠移植瘤中MMP-2、MMP-9、iNOS、eNOS mRNA的表达无明显影响。


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