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肝脏基质微环境对免疫细胞分化和功能的调控作用及其机制研究

夏圣  
【摘要】: 肝脏具有非常独特的免疫系统。一方面,在肝脏中存在多种淋巴细胞,包括T细胞,NK细胞,NKT细胞等,它们可以识别病原微生物和毒素,启动免疫应答以清除外来有害异物。另一方面,从小肠中吸收来的大量营养物质通过门静脉进入肝脏进行代谢,同时也带来了大量无害的食物抗原,目前的研究表明,从门静脉进入肝脏的抗原更容易诱发耐受,称之为“门脉耐受现象”。因此,肝脏局部的免疫反应需要非常精细的调节,才能保证在特定的情况下正确选择是启动免疫应答还是诱导免疫耐受。而对于这种调节的机制,目前所知甚少。除了抗原进入的途径不同外,肝脏中存在的多种免疫细胞也可以分布到全身其他地方,它们为何在肝脏中既可以诱导免疫耐受,又可以激发免疫应答?对这一问题的回答将研究的方向指向了肝脏的免疫微环境:此现象提示肝脏微环境具有独特的功能,即可能通过对不同细胞的分化及功能进行调控,从而可以在免疫应答和维持耐受中发挥着重要作用。 研究资料表明,肝脏基质可以支持胚胎期及成年期病理状态下的造血,且过继的骨髓细胞可以定位于肝脏并分化成成熟的肝细胞、kupffer细胞和肝星形细胞。同时,有文献报道同为胚胎期造血器官的脾脏基质细胞,在体外能诱导骨髓前体或干细胞分化为高分泌IL-10,低分泌IL-12的调节性树突状细胞。那么,肝内基质细胞在出生后是否还保留有诱导造血前体细胞分化的功能,这种分化与肝脏免疫耐受或免疫应答之间又有何关系?另外,NK细胞在正常肝脏内尤其丰富,占肝内淋巴细胞的30%左右。当肝脏内发生病毒感染或炎症时,其比例还会更高。为什么NK细胞在肝脏内如此高比例的聚集?是肝脏内存在有NK细胞的原位分化,还是肝脏微环境对肝外的NK细胞有趋化、储留效应?肝脏微环境对于肝脏中存在的大量的NK细胞的功能会有何影响?此种功效是否也参与了免疫耐受或免疫应答的调节?这些问题都有待于进一步研究。 作为构成肝脏器官微环境的重要组成部分,基质细胞在维持肝脏器官形态、营养细胞、调节器官内细胞分化等多方面发挥重要作用。因而,我们选择用肝脏基质细胞来模拟肝脏微环境,观察其对造血前体细胞或NK细胞的影响,希望可以在一定程度上反映肝脏微环境的效应,为深入阐明肝脏局部免疫反应的精细调节提供新的视角。 首先,我们利用组织培养技术从新生小鼠肝脏中分离到肝脏基质细胞,并对其细胞类型进行了鉴定。免疫组织化学的结果表明:分离到的肝基质细胞胞内表达Vimentin和Desmin,但不表达Cytokeratin-7,亦不分泌白蛋白;吞噬试验的结果表明:该细胞不吞噬LDL;而RT-PCR的检测结果则显示:该细胞表达a-SMA(a-smooth muscle actin)和多种基质组份的mRNA,包括Ⅰ型胶原(a1(Ⅰ)collagen)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TLMP-1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2),但不表达GFAP(glial fibrillary acid protein)。从以上结果来看,该细胞具有肝脏内成纤维母细胞的特性。成纤维母细胞是肝脏基质细胞中的主要细胞类型之一,主要分布在肝脏的门脉部位。肝内大部分树突状细胞的主要定居部位也是在肝脏门脉部位。因而,肝脏内树突状细胞独特的功能及表型可能与其定居局部附近的肝脏基质细胞形成的局部微环境有关。在肝脏发生感染、炎症或损伤时,大量的肝星形细胞也会活化,甚至转化为成纤维类细胞,这些肝脏内病理性改变也与肝脏免疫密切相关。因此,成纤维基质细胞在一定程度上可反映肝脏微环境,从而可用来研究肝脏微环境对NK细胞的分化及功能调控的影响。 为研究肝脏免疫微环境对前体细胞分化的效应,我们将骨髓来源的造血前体细胞与分离的肝脏基质细胞共育。结果发现,肝脏基质细胞能诱导前体细胞分化为一类具有免疫调节功能的树突细胞样细胞(Liver regulatory dendritic cells,LRDCs)。从镜下培养特性和染色后形态观察:该细胞为髓样细胞表现,并伸出类似传统意义上的DC(Conventional dendritic cells,cDCs)相似的树突样结构。流式分析结果显示:其表型特征为不表达CD4、CD8a、B220、Gr-1、CD14和B7DC;但低水平表达CD1c、I-A~b、CD54、CD40、CD86;中高水平表达CD11b、CD80、B7H-1。cDCs最重要的功能是能将抗原递呈给抗原特异性T细胞,并诱导其活化与增殖。故而,我们利用OVA_(323-339)特异性TCR转基因鼠的CD4~+T细胞,对LRDCs的抗原递呈功能进行了分析。发现LRDCs能将抗原递呈给T细胞,但不能有效地诱导CD4~+T细胞的增殖,仅能引起CD4~+T细胞一定程度的活化。另外,该细胞还呈现出较cDCs更强的吞噬功能。提示这是一群不同于cDCs的DC细胞。 TLR(Toll-like receptors)是广泛表达在免疫细胞表面的一类模式抗原识别受体,对于激活机体的天然免疫和过继免疫有着非常重要的作用。当LPS通过与表达在DC细胞表面的TLR4结合后,可促使DC成熟,高分泌IL-12,同时上调其MHC-Ⅱ类分子表达及抗原递呈功能。但LRDCs在受到LPS刺激后,高分泌IL-10、低分泌IL-12;其表型特征没有明显改变。而此特性与以前报道的调节性DC的特征相似。因此,我们设想该细胞是否也有免疫调节功能?利用CFSE标记的OVA_(323-339)肽抗原特异性转基因鼠的CD4~+T进行的体内、体外抗原特异性增殖试验结果表明:LRDCs明显抑制cDCs激活的OVA_(323-339)肽抗原特异性CD4~+T的增殖反应。此结果说明:LRDCs有负向免疫调节功能。 那么基质细胞是通过何种机制来诱导前体细胞分化为LRDCs的?分化的LRDCs又是通过何种机制来实现对抗原特异性激活的CD4~+T细胞的增殖抑制?我们利用Transwell培养体系和纯化的基质细胞膜蛋白进行的实验表明:基质细胞膜蛋白与其培养上清都在诱导前体细胞分化为LRDCs中起作用;其中,主要以细胞培养上清为主。进一步利用抗体阻断试验进行的研究结果表明:阻断基质细胞培养上清中的M-CSF可以大大降低基质细胞诱导前体细胞分化为LRDCs的效率。说明基质细胞分泌的M-CSF在LRDCs的分化中起一定的作用。为进一步阐明LRDCs体外抑制抗原特异性T细胞活化增殖的机制,我们针对LRDCs的特性,分别用IL-10、TGF-β、B7H-1的中和性抗体、PGE2的阻断剂消炎痛及IDO抑制剂来阻断LRDCs的生物学效应,结果发现PGE_2的阻断剂消炎痛能大部分逆转LRDCs对T细胞增殖的抑制效应。此结果说明:LRDCs在一定程度上是通过分泌PGE_2来实现其免疫抑制功能的。 IFN-γ是一类主要由活化的Th1细胞分泌的细胞因子。传统的观念认为:IFN-γ主要参与并促进细胞免疫的发生,当其过度反应时可引发自身免疫性疾病的发生。但是,现在越来越多的证据表明:IFN-γ可通过诱导Th2细胞反应、激活拮抗Th1细胞活化的细胞因子的上调、诱导活化的T细胞凋亡及诱导调节性T细胞的产生等多种机制,来实现其抗炎症反应、诱导免疫耐受等多种免疫调节功能。在本研究中,我们发现LRDCs在抑制OVA_(323-339)肽抗原特异性CD4~+T细胞增殖时,其共培养上清中IFN-γ分泌水平上调。考虑到IFN-γ在免疫耐受与免疫负向调节中的作用,我们不禁要问:高分泌的IFN-γ是否也是LRDCs负向调节功能的机制之一呢?鉴于IFN-γ参与诱导活化的T细胞发生凋亡,那么在LRDCs的效应中除了CD4~+T细胞增殖抑制外,是否还有活化CD4~+T细胞的凋亡发生?为此,我们首先分析了实验各组中的CD4~+T细胞的凋亡率,结果发现:LRDCs能够诱导活化的CD4~+T细胞发生凋亡。利用中和性抗IFN-γ抗体进行的阻断试验进一步证实:当IFN-γ被阻断后,LRDCs介导的抗原特异性T细胞增殖抑制现象被部分逆转,同时,凋亡发生率也下调。这一结果表明加入LRDCs共培养后,上清中高分泌的IFN-γ是其抑制抗原特异性T细胞增殖和诱发其凋亡的又一机制。 为进一步利用体内试验说明LRDCs的负向免疫调节功能,我们还利用冰浴匀浆+超速离心法制备的正常小鼠自身肝脏抗原(S100)和福氏完全佐剂共同免疫小鼠,制备了小鼠自身免疫性肝炎的模型,并利用此模型来研究过继的LRDCs细胞是否对此自身免疫病的发生也有抑制效应。动物试验的结果表明:LRDCs的过继能够减轻该模型的病理损害。此结果进一步说明:LRDCs可能是构成肝脏免疫耐受并维持肝脏免疫自稳的因素之一。 以上的实验结果都是建立在体外分化的LRDCs的研究基础之上,那么体内是否有这一群细胞呢?为此,我们首先根据LRDCs的主要表型CD11b~(hi)CD11c~(low)IA~(low),对分离的肝脏内非实质细胞进行了分析,发现在其中有类似表型的细胞群存在。利用流式分选技术将此细胞分选出来所做的细胞因子分泌谱、对OVA_(323-339)肽抗原特异性CD4~+T细胞的增殖抑制试验等结果表明:此细胞特性类似于体外分化的LRDCs细胞,说明肝脏内存在有类似LRDCs的免疫抑制性细胞群。由于体外实验表明:LRDCs是由骨髓造血前体细胞经肝脏基质细胞诱导分化而来,那么体内的相应群体是否也可由造血前体分化而来?为证明此假设,我们建立了经肠系膜静脉过继前体细胞进入肝内,进行了肝内前体细胞原位发育的实验研究。实验结果表明:将骨髓来源的造血前体细胞经肠系膜静脉过继后,前体细胞主要滞留在肝内并可完成肝内的原位分化发育。经流式分析过继GFP~+造血前体细胞分化后的表型结果说明,骨髓来源的造血前体细胞在肝内分化成多群细胞,其中包括与LRDCs有相似表型的细胞群。此结果在体内证明了肝脏内LRDCs的相应群体也可由骨髓来源的造血前体细胞分化而来。以上实验结果表明,肝脏微环境可以促进造血前体细胞分化为具有免疫负向调节功能的树突状细胞,这一效应可能参与肝脏免疫耐受的形成。 另外,对于在肝脏中高比例存在的NK细胞,我们提出两种假设:一是肝脏内可能存在有NK细胞的原位分化;其二,肝脏可趋化外周NK细胞进入肝内并滞留肝内。而此两种假设都是建立在肝脏微环境对NK细胞的影响基础之上。因而,我们利用肝基质细胞模拟肝脏微环境研究了其对NK细胞分化、趋化及活化等生物学特性的影响。结果发现:骨髓来源的Lin~-CD117~+在外源性IL-15存在条件下,与肝基质细胞共育后,部分前体细胞可分化成NK1.1阳性细胞。该细胞能分泌IFN-γ、并表达Perforin和Granzyme B。其中,部分分化的NK1.1阳性细胞还表达Ly49A,表现出了immature NK细胞的细胞特性。进而利用Transwell培养体系和阻断性抗体的试验结果表明,该immature NK细胞的分化同时依赖IL-15和肝基质细胞分泌的细胞因子。 我们还利用该基质细胞模拟肝脏微环境研究了其对外周NK细胞趋化、活化的影响。考虑到肝脏是病毒极易感染的器官,病毒感染后肝内成纤维细胞极易活化、增生。因而,利用肝成纤维细胞模拟肝基质微环境在一定程度上也可反映肝炎情况下肝脏的微环境。PolyI:C是病毒TLR3的配体,可模拟病毒RNA激活免疫应答。在实验中,我们利用Polyl:C活化的NK细胞与肝基质细胞共培养,来探讨肝脏微环境对病毒感染后NK细胞的影响。结果表明:NK细胞表达TLR3,并能被Poly I:C所活化。肝基质细胞可通过分泌的因子趋化NK细胞,尤其是Poly I:C活化的NK细胞向基质细胞粘附,而且,肝脏基质细胞还可以促进Poly I:C活化的NK细胞的进一步活化,表现为IFN-γ分泌的增加及NK细胞杀伤活性的增强。这一促进效应是通过基质细胞表面表达的Fibronectin与NK细胞表面的配体结合来实现的。以上结果提示肝脏免疫微环境可以促进NK细胞的肝内分化、外周趋化及在肝内的活化功能进一步增强,此效应可能参与肝脏内对外源性病原微生物的免疫应答的启动。 综上所述,在本研究中,我们在体外分离培养了成纤维样肝脏基质细胞,利用该细胞来模拟肝脏的免疫微环境,观察了其对造血前体细胞和NK细胞的不同效应。结果发现,肝脏基质细胞可以促进造血前体细胞分化成具有负向免疫调节功能的树突状细胞,同时,在IL-15存在的条件下,可以促进部分前体细胞分化为Immature NK细胞,并可以促进活化NK细胞的进一步的活化。以上结果提示,肝脏的免疫微环境可能通过对肝脏内不同细胞的不同调控作用,来实现肝脏对特定抗原诱导免疫耐受或免疫应答的精确调控。


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